四種發(fā)育調(diào)控因子mRNA在早期雞胚中的分布及其在胚胎發(fā)育中的作用研究.pdf

1、采用體外轉(zhuǎn)錄的方法，分別在SP6和T7 RNA聚合酶的作用下合成地高辛(DIG)標(biāo)記的Cdc25A，Cdc25B，Sox2和Mnb/Dyrk RNA探針。通過全胚胎原位雜交的方法檢測早期雞胚中上述四種基因mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果表明，四種基因mRNA的表達(dá)模式是部分重疊或互補的，大部分表達(dá)于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，但也有表達(dá)于體節(jié)和肢芽。在特異的區(qū)域，四種基因的mRNA豐度是存在差異的。在雞胚早期不同發(fā)育階段，四種基因的表達(dá)模式支持

2、了它們可能在早期的雞胚發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)功能，而且它們之間具有一定的相互調(diào)控作用。
　　 試驗Ⅰ Cdc25A RNA探針的制備本試驗應(yīng)用RT-PCR方法從雞胚中擴(kuò)增Cdc25A的基因片段，通過T-A克隆將其連接于pGM-T質(zhì)粒載體中構(gòu)成Cdc25A/pGM-T重組質(zhì)粒。并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α株感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增，經(jīng)挑取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、小量提取質(zhì)粒，再根據(jù)pGM-T的多克隆酶切位點，進(jìn)行酶切鑒定，然后經(jīng)測序驗證

3、。測序正確后，將陽性株擴(kuò)增后提取的質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SpeⅠ進(jìn)行酶切，使其完全線性化?；厥彰盖衅危鳛楹铣烧?、反義RNA探針的模板。分別利用pGM-T中T7和SP6的RNA聚合酶的啟動子，在RNA聚合酶的作用下，以線性化的Cdc25A/pGM-T為模板，按Roche地高辛標(biāo)記試劑盒說明書，利用試劑盒中含有的DIG-dUTP底物混合物，分別用Sp6和T7轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，成功轉(zhuǎn)錄得到長度為183nt的正、反義DIG標(biāo)記的

4、RNA探針，為后續(xù)的原位雜交試驗做好了探針的準(zhǔn)備。
　　 試驗Ⅱ Cdc25A mRNA在早期雞胚中的分布本試驗通過全胚胎原位雜交的方法，使用Cdc25A RNA探針檢測其mRNA在早期雞胚中的分布。結(jié)果表明，在9HH(Hamburger and Hamilton)階段，腦部的雜交信號相對于后期階段(10，11HH)不強，但中部神經(jīng)管雜交信號相對于后期階段較強。后部神經(jīng)溝，尾部神經(jīng)板雜交信號此時較強。體節(jié)部位信號最弱。在10HH

5、階段，腦部雜交信號此時很強，但中部神經(jīng)管雜交信號很弱。體節(jié)處的雜交信號也較少。后部神經(jīng)溝，尾部神經(jīng)板雜交信號依然較強。在11HH階段，頭部區(qū)域的雜交信號仍然最強，中部神經(jīng)管雜交信號有所加強，后部神經(jīng)溝，尾部神經(jīng)板雜交信號有所減弱.此時，在心原基中未見雜交信號。這些結(jié)果說明，Cdc25A mRNA的表達(dá)模式與增殖中的神經(jīng)上皮分布區(qū)域基本一致。
　　 試驗Ⅲ Cdc25B RNA探針的制備及其mRNA在早期雞胚神經(jīng)管、體節(jié)和肢芽中的

6、分布本試驗使用分子克隆的方法獲得特異性Cdc25B基因目的片段，以線性化的Cdc25B/pGM-T重組質(zhì)粒為模板，應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法合成長度為575nt的正、反義地高辛標(biāo)記的Cdc25B RNA探針。通過全胚胎原位雜交方法，用體外轉(zhuǎn)錄的Cdc25BRNA探針探查Cdc25B mRNA在早期雞胚中的動態(tài)表達(dá)模式。結(jié)果表明，在5HH階段，Cdc25B原位雜交信號在整個胚胎中分布是微弱的，特別是在頭部區(qū)域，但在亨氏節(jié)(Hensen's nod

7、e)中雜交信號可見。此時，Cdc25B雜交信號不對稱地分布在亨氏節(jié)的左側(cè)。在6HH階段，腦部雜交信號已經(jīng)清晰可見。雜交信號在亨氏節(jié)和原條兩側(cè)是不對稱的。到了8-HH期，腦部雜交信號很強，并且在神經(jīng)褶中Cdc25B原位雜交信號也較強。此時，神經(jīng)褶兩側(cè)雜交信號分布是對稱的，但亨氏節(jié)兩側(cè)信號仍然是不對稱的。在全胚胎原位雜交的橫斷切片中，Cdc25B原位雜交信號分布在底板。在即將封閉的神經(jīng)管中，雜交信號呈現(xiàn)出腹背遞減的濃度梯度，而且，在大部分尾

8、部神經(jīng)上皮中缺乏雜交信號。體節(jié)中的雜交信號很弱。直到8HH階段，Cdc25B原位雜交信號在腦部很強。在體節(jié)中的雜交信號也較強。從Cdc25B原位雜交的橫斷切片來看，在8HH階段，雜交信號在神經(jīng)管和神經(jīng)溝兩側(cè)是對稱的，但在即將封閉的神經(jīng)管和神經(jīng)溝中，雜交信號仍然呈現(xiàn)出腹背遞減的濃度梯度。從9－到10HH階段，雜交信號分布于CNS，包括腦部，神經(jīng)管和神經(jīng)溝。特別是，腦部的雜交信號很強，但是在10HH階段，在尾部神經(jīng)板中沒有雜交信號。此外，體

9、節(jié)中的信號較強。在12HH階段，Cdc25B原位雜交信號分布于CNS，特別是腦部比先前發(fā)育階段信號更強。此時，體節(jié)中的雜交信號較強。在三天的雞胚(18HH階段)切片中，Cdc25B原位雜交信號仍然分布在神經(jīng)管的腹部區(qū)域。體節(jié)中信號很強。同時在肢芽的頂端，即AER區(qū)域，Cdc25B原位雜交信號很強。在后期的23HH階段，雜交信號廣泛分布于發(fā)育中的脊髓，主要分布在腹部區(qū)域，并且在腹部區(qū)域的外側(cè)緣檢測到強烈的信號。此時，體節(jié)中信號也較強。然而

10、，自始至終，在早期雞胚不同發(fā)育階段，脊索都是陰性的。所有這些結(jié)果說明，在早期雞胚不同發(fā)育階段，Cdc25B mRNA主要分布于CNS，在體節(jié)和肢芽中也有不同程度地分布。但是，大部分尾部神經(jīng)上皮中缺乏Cdc25B mRNA分布。
　　 試驗Ⅳ Sox2 RNA探針的制備及其mRNA在早期雞胚中的原位雜交檢測本試驗應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法合成正、反義地高辛標(biāo)記的Sox2 RNA探針。通過全胚胎原位雜交方法，使用體外轉(zhuǎn)錄的探針檢測Sox2

11、mRNA在10HH階段雞胚中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Sox2原位雜交信號沿著CNS區(qū)域分布。雜交信號在腦部很強。中部神經(jīng)管的雜交信號較弱。然而，在尾部神經(jīng)板雜交信號較強。此外，在體節(jié)中并未見到雜交信號。這些結(jié)果說明，Sox2 mRNA主要分布在CNS未成熟的神經(jīng)上皮中。Sox2 mRNA與Cdc25A mRNA在早期雞胚中的分布模式具有相似性。
　　 試驗Ⅴ Mnb/Dyrk RNA探針的制備及其全雞胚原位雜交反應(yīng)本試驗應(yīng)用體外轉(zhuǎn)

12、錄的方法合成正、反義地高辛標(biāo)記Mnb/Dyrk的RNA探針。通過全胚胎原位雜交方法，用體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針檢測了10HH階段的雞胚M(jìn)nb/Dyrk mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果表明，Mnb/Dyrk原位雜交信號在CNS中很強。在封閉的神經(jīng)管中可檢測到雜交信號，包括將來發(fā)育為前腦，中腦和菱腦的區(qū)域，以及脊髓。在頭部有很強的雜交信號。尾部神經(jīng)板區(qū)域雜交信號很弱。此外，在體節(jié)中雜交信號很弱。這些結(jié)果說明，Mnb/Dyrk mRNA主要分布于CNS