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文檔簡(jiǎn)介
1、白細(xì)胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是1995年由Okmura等從小鼠肝臟中克隆獲得的一種細(xì)胞因子,主要由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞分泌,具有強(qiáng)烈的IFN-γ誘生能力,對(duì)機(jī)體起著重要的免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)作用,在抗微生物感染、抗腫瘤免疫中具有應(yīng)用潛力。對(duì)人和哺乳動(dòng)物IL-18的研究已有許多報(bào)道,而雞IL-18(ChIL-18)基因發(fā)現(xiàn)得比較晚,由于它具有與人和哺乳動(dòng)物相似的生物學(xué)功能,因此ChIL-18在比較免疫學(xué)研究和禽
2、病治療中具有重要意義。
本實(shí)驗(yàn)室從2001年開始進(jìn)行雞白細(xì)胞介素18的研究,已經(jīng)在原核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)基因的高效表達(dá),但由于該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白存在非糖基化形式等缺陷,使得表達(dá)的蛋白分子常失去天然結(jié)構(gòu),因而對(duì)表達(dá)的重組蛋白的活性還存在爭(zhēng)議。
本試驗(yàn)利用昆蟲/桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白,進(jìn)而對(duì)該重組蛋白有效地進(jìn)行了生物學(xué)活性檢測(cè)。參考已發(fā)表的mChIL-18的c
3、DNA基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,以pMD18-T-mChIL-18質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增出編碼mChIL-18成熟蛋白基因的cDNA片段。再以桿狀病毒pFastBacTMHTb為載體,將mChIL-18基因插入到表達(dá)載體pFastBacTMHTb的多角體蛋白啟動(dòng)子PPH的下游,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacTMHTb-mChIL-18,然后將已構(gòu)建好的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)座入大腸桿菌DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)三次藍(lán)白斑篩選純
4、化后提取質(zhì)粒,通過(guò)一對(duì)通用引物M13(Bacmid含有該引物Forward和Reverse兩個(gè)引物位點(diǎn),能夠從兩側(cè)擴(kuò)增LacZα互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的mini-attTn7位點(diǎn),有利于PCR分析)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,得到重組Bacmid(Bacmid-mCMIL18)。在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin的作用下,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將純化的Bacmid-mChIL-18轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾細(xì)胞(Spodoptera frugiperda9,sf9)獲得P1代
5、重組桿狀病毒,用P1代病毒反復(fù)感染sf9來(lái)擴(kuò)增病毒滴度,將達(dá)到一定滴度(107~108pfu/mL)的重組桿狀病毒再感染sf9,并在感染后不同時(shí)間段收獲sf9細(xì)胞及培養(yǎng)上清,然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎,離心后分別取裂解上清和沉淀,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析、Western blotting和間接免疫熒光(IFA)檢測(cè),結(jié)果表明,mChIL-18基因在昆蟲細(xì)胞sf9中獲得了表達(dá),表達(dá)的目的條帶分子量約為23KD。
采用雞脾淋巴
6、細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法)、IFN-γ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和水皰性口炎病毒(VSV)抑制試驗(yàn)對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。
雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明,mChIL-18融合蛋白能夠明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,不同濃度的蛋白均可刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。當(dāng)濃度為200ng/mL時(shí),刺激轉(zhuǎn)化效果最佳,但隨著蛋白濃度的增大,淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)則會(huì)降低:VSV病毒活性抑制試驗(yàn)表明,當(dāng)?shù)鞍诐舛却笥?00ng/mL時(shí)能刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,并且隨著mC
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