魚源Ⅲ型抗凍蛋白基因的原核表達(dá)及轉(zhuǎn)革胡子鯰魚方法模型的建立.pdf

1、魚是人類肉食消費(fèi)品中較為偏好的重要蛋白質(zhì)來源。本研究采用的革胡子鯰屬熱帶、亞熱帶魚類，生長(zhǎng)快，肉質(zhì)細(xì)嫩、味似淡水鰻鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富。除其蛋白質(zhì)含量高外尚有一定的藥用價(jià)值，可促進(jìn)傷口愈合，具有補(bǔ)血、益陽等功效。但是耐低溫能力差，當(dāng)溫度降到7℃以下時(shí)，則開始死亡。其能適應(yīng)溫度范圍為8～38℃，繁殖適宜水溫最佳為27～32℃、18℃時(shí)基本不產(chǎn)卵。在北方地區(qū)，“10.1”國(guó)慶節(jié)后一個(gè)星期內(nèi)，鯰魚要全部起捕上市，以免在池塘中凍死。如果要想在冬天吃到

2、鮮活的革胡子鯰，水溫至少要保持在13℃以上。這對(duì)北方的冬季來說很難做到，所以利用生物工程技術(shù)將有用的魚類抗寒性基因?qū)媵~卵以期改良其抗凍性能，為培育出耐低溫的革胡子鯰魚提供了新途徑，同時(shí)也使北方消費(fèi)者冬季可享用到鮮美的革胡子鯰成為可能。 本研究以Ⅲ型抗凍蛋白基因?yàn)榛A(chǔ)，采用基因重組技術(shù)將AFPⅢ基因與原核表達(dá)載體pET32a（+）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），通過PCR、酶切及測(cè)序鑒定構(gòu)建結(jié)果。在合適的培養(yǎng)條件下通過IP

3、TG的誘導(dǎo)使得Ⅲ型抗凍蛋白高效表達(dá)，將表達(dá)出的融合蛋白純化后，免疫6-7周齡的小白鼠制備出了鼠抗血清。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因魚中抗凍蛋白的表達(dá)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)為了研究Ⅲ型抗凍蛋白生物學(xué)功能，我們通過細(xì)菌低溫保護(hù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定其對(duì)大腸桿菌的低溫保護(hù)效果。利用前期純化的蛋白以不同的濃度梯度加到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌中，低溫處理細(xì)菌培養(yǎng)液（-10℃），一段時(shí)間后平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，活細(xì)菌個(gè)數(shù)越多表明存活率越高，抗凍蛋白的低溫保護(hù)活性越高。得出Ⅲ型抗凍