邊緣無漿體MSP5基因的克隆、原核表達及ELISA方法的建立.pdf

1、邊緣無漿體病是由蜱傳播的、邊緣無漿體寄生于牛紅細胞內所引起的立克氏體病.該病幾乎遍布我國各省(區(qū)),嚴重威脅著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展. 本試驗根據已發(fā)表的:MSP5基因序列,設計引物,利用PCR技術自感染邊緣無漿體基因組DNA中擴增MSP5基因,通過將產物與pGEM-T Easy載體連接,構建重組克隆載體pGEM-TEasy-MSP5.基因測序結果表明,本試驗所獲得的.MSP5基因核苷酸序列和所編碼氨基酸的序列與GenBank中收錄的邊緣

2、無漿體國外株的同源性分別為98.6﹪和99﹪.根據開放閱讀框(ORF)兩側序列重新設計并合成表達引物,以重組質粒pGEM-T Easy-MSP5為模板,進行PCR擴增,將擴增產物與pGEX-4T-1質粒連接,構建了重組原核表達載體pGEX-4T-1-MSP5,將其轉化到DH5a宿主菌中,用IPTG進行誘導表達,所表達的目的蛋白部分為分泌性表達,大部分呈包涵體.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,MSP5基因在大腸桿菌中成

3、功獲得了表達,目的蛋白約占菌體總蛋門的35.0﹪,并與GST形成融合形式,分子量大小為45Ku左右,與預期的大小相吻合,且可被兔抗牛邊緣無漿體陽性血清所識別. 通過裂解、洗滌、變性、復性等方法對包涵體蛋白進行處理,以所獲得的純化產物作為抗原,構建了ELISA診斷方法;實驗證實,該方法的陽性符合率和陰性符合率分別為100﹪(100/100)和98﹪(98/100):對實驗感染牛的抗體消長規(guī)律進行了觀察,結果顯示,動物感染后第5天即

4、可查出抗體(滴度為1:50),第90天時抗體達到高峰(滴度為1:3200),然后逐漸下降,感染后第5個月抗體效價為1:1600;對自新疆、內蒙古、黑龍江、吉林、四川和甘肅六省區(qū)的血清樣品進行了檢測,陽性率分別為67.63﹪(700/1035)、81.78﹪(184/225)、82.78﹪(149/180)、 46.11﹪(139/180)、66.67﹪(83/180)和77.22﹪(90/135),結果與過去采用病原學檢測獲得的結果基本