隱孢子蟲rP23間接ELISA診斷方法及體內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)感染動物和人引起的一種寄生蟲病,以自限性水樣腹瀉為主要癥狀。隱孢子蟲能感染170多種動物,其中哺乳動物至少有79種。隱孢子蟲卵囊在環(huán)境中普遍存在,人類可以通過多種途徑獲得感染。但目前隱孢子蟲病還沒有特效的治療藥物,因而對其進(jìn)行檢測與預(yù)防很重要。
　　 本實驗利用酶切法從重組質(zhì)粒pMD18-T-P23中獲得隱孢子蟲鼠基因型(Cry

2、ptosporidiummouse genotype)P23基因,克隆到pGEX-4T-1載體,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-P23。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rP23可分別與兔隱孢子蟲感染兔陽性血清、貝氏隱孢子蟲感染雞陽性血清、微小隱孢子蟲感染牛陽性血清、隱孢子蟲鼠基因型感染鼠陽性血清特異性反應(yīng),而不與兔、雞、牛、鼠陰性血清反應(yīng),

3、表明表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性。
　　 以純化的重組蛋白rP23為抗原,建立隱孢子蟲間接ELISA檢測方法,對其敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行觀察；利用建立的方法,對臨床血清樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果成功地建立了隱孢子蟲間接ELISA檢測技術(shù),其最適抗原包被濃度為2μg／mL,血清最佳稀釋倍數(shù)為1:800,酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:2000,具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。利用建立的rP23-ELISA檢測方法,對23份臨床血清樣品

4、進(jìn)行了檢測,并與Sheather's蔗糖漂浮法、nested PCR法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,建立的rP23-ELISA方法檢出率高于Sheather's蔗糖漂浮法和nested PCR法。表明該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng),重復(fù)性好、價格低廉、操作簡單、能批量檢測等特點.可用來對臨床樣品進(jìn)行檢測,為研制隱孢子蟲病ELISA檢測試劑盒打下了基礎(chǔ)。
　　 為建立微小隱孢子蟲體外感染模型,并對其在細(xì)胞內(nèi)的生長發(fā)育過程進(jìn)行觀察,利用

5、人回盲腸癌細(xì)胞(HCT-8細(xì)胞)作為感染細(xì)胞,采用不同的接種細(xì)胞濃度和培養(yǎng)血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果,在6孔培養(yǎng)板中接種1×106、5×105、1×105個細(xì)胞后,在24h、48h、72 h后長成70～80％單細(xì)胞層,可以用來接種1×105個微小隱孢子蟲。用含有1％血清濃度的培養(yǎng)基來培養(yǎng)微小隱孢子蟲,培養(yǎng)72 h后,通過Crypt-a-GloTM和Sporo-GloTM抗體熒光染色,成功觀察到了隱孢子蟲各個階段蟲體的形態(tài)。
　　 為

6、探索綠色熒光蛋白(EGFP)在隱孢子蟲中的瞬時表達(dá)情況,分別擴(kuò)增了微小隱孢子蟲自身蛋白子孢子表面抗原CP15、熱激蛋白70、組蛋白H4、肌動蛋白、微管素蛋白和ATP酶的啟動子序列,并將外源蛋白EGFP基因置于其啟動子中,共構(gòu)建了30個穿梭轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入微小隱孢子卵囊中,培養(yǎng)72h后,用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡和RT-PCR檢測EGFP表達(dá)情況。結(jié)果pSEI和pAET兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測均觀察到EGFP熒光,R