高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究-碩士論文

1、<p>　　分類(lèi)號(hào)：密 級(jí)：公開(kāi)</p><p>　　學(xué) 號(hào)：2010108013單位代碼：10759</p><p><b>　　石河子大學(xué)</b></p><p>　　碩 士 學(xué) 位 論 文</p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵</p><p><b>　

2、　棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</b></p><p><b>　　中國(guó)新疆石河子</b></p><p>　　2013 年 5 月</p><p>　　A Study on Screening and Breeding of High-yield Lactic Acid</p><p>　　Bacteria and

3、the nutritional characteristics of Fermented</p><p>　　Cottonseed Meal</p><p>　　A Dissertation Submitted to</p><p>　　Shihezi University</p><p>　　In Partial Fulfillment

4、of the Requirements</p><p>　　for the Degree of</p><p>　　Master of Agriculture</p><p><b>　　By</b></p><p>　　Yan-Yan Wu</p><p>　　(Animal Nutrition

5、 and Feed Science)</p><p>　　Dissertation Supervisor: Prof. Wen-Ju Zhang</p><p><b>　　May，2013</b></p><p>　　Shihezi, Xinjiang, China</p><p><b>　　I</b

6、></p><p><b>　　要 </b></p><p><b>　　II</b></p><p>　　目的：本研究以嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）為出發(fā)菌種，篩選出高產(chǎn)酸性能的嗜酸乳酸 菌，以棉粕和玉米為固體發(fā)酵底物，采用所選育菌種進(jìn)行發(fā)酵，研究發(fā)酵條件參數(shù)、底料組成、接 種量

7、的優(yōu)化以及發(fā)酵產(chǎn)物代謝組分和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 。并就發(fā)酵棉粕對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、血液理化指標(biāo)和 免疫指標(biāo)的影響進(jìn)行了研究。為嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕的綜合評(píng)定和合理利用提供理論支撐。</p><p>　　方法：本研究由四個(gè)部分組成。試驗(yàn)一: 從S1、W2、J2三株嗜酸乳桿菌中選取一株產(chǎn)乳酸較高 、生長(zhǎng) 較好的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行自然選育出一株高產(chǎn)乳酸的菌株 ，并鑒定其為嗜酸乳桿菌。試驗(yàn)二:旨</p><p&g

8、t;　　在優(yōu)化嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕的發(fā)酵工藝，采用 4 因子5 水平的正交設(shè)計(jì)法和二因子有重復(fù)觀察值相結(jié) 合的設(shè)計(jì)方法，通過(guò)發(fā)酵底物中乳酸含量，確定發(fā)酵參數(shù)、發(fā)酵底料組成和接種比例。 試驗(yàn)三：分 別采用嗜酸乳桿菌 S5、W2、J2按照試驗(yàn)二的優(yōu)化條件發(fā)酵棉粕，分 別為對(duì)照組、S5組、W2組、J2</p><p>　　組共4 組，研究發(fā)酵產(chǎn)物中有機(jī)酸、B族維生素、游離氨基酸含量的變化。 試驗(yàn)四：選取1 日齡AA肉&l

9、t;/p><p>　　仔雞100羽，隨機(jī)分成2 組，每組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 10羽，對(duì)照組添加6%的未發(fā)酵棉粕，試驗(yàn)組添 加6%的發(fā)酵棉粕，研究嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕對(duì) AA肉仔雞生長(zhǎng)性能、血液理化指標(biāo)及免疫指標(biāo)的影 響。</p><p>　　結(jié)果：試驗(yàn)一：菌株S5在培養(yǎng)36 h 后其產(chǎn)酸量可達(dá)2.14 g/L，通過(guò)生理生化鑒定和 16SDNA全序列分 析法確定其種屬，然后經(jīng)過(guò) Gene Ban

10、k基因比對(duì)確定同源基因，用 DNAMAN軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)， 鑒定為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。試驗(yàn)二：嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕的優(yōu)化結(jié)果為 ：溫度 為37℃、時(shí)間為48 h、底物初水分為30%、初始pH為6 、底料組成為棉粕：玉米為9：1；接種量為50 mL/kg。試驗(yàn)三：S5組較對(duì)照組，戊酸含量極顯著提高了49.32%，琥珀酸、檸檬酸顯著降低了77.57%、 1.93%，VB1 、VB2 、VB5的含

11、量極顯著提高了28.53%、50.91%、89.47%（P<0.01），亮氨酸、賴(lài)氨酸 含量分別極顯著提高了19.84%、33.63%（P <0.01）；W2組較對(duì)照組，戊酸、檸檬酸顯著提高了79.82%、</p><p>　　10.77%（P <0.01），VB1、VB3 、VB5極顯著降低了19.43%、91.35%、23.52%（P<0.01），亮氨酸、苯</p>&l

12、t;p>　　丙氨酸含量分別極顯著降低了 16.64%、4.43%（P <0.01）；J2組較對(duì)照組，戊酸、琥珀酸的相對(duì)含量</p><p>　　極顯著提高了127.19%、14.95%（P <0.01），VB1、VB2、VB3、VB5分別極顯著降低了44.54%、23.50%、</p><p>　　91.47%、23.52%（P <0.01）。試驗(yàn)四：添加嗜酸乳桿菌

13、發(fā)酵棉粕后，（1 ）在0 ～42日齡，肉雞平均日</p><p>　　采食量、平均日增重分別顯著提高了10.20%和15.41%（P<0.05），料重比下降了4.63%（P>0.05）；（2 ）</p><p>　　在0 ～21日齡，肉雞血清中白蛋白、總蛋白分別顯著提高了 10.64%、5.68%（P<0.05），甘油三酯顯</p><p>　　著

14、提高了23.73%（P<0.05），總膽固醇顯著降低了 6.72%（P<0.05）；（3 ）在21～42日齡，肉雞血清</p><p>　　白蛋白提高了2.86%，但差異不顯著（P>0.05），總蛋白顯著提高了8.14%（P<0.05）；甘油三酯顯著</p><p>　　提高了9.68%，總膽固醇極顯著降低了 25.49%（P<0.01）；血清免疫球蛋白IgG

15、、IgA、IgM含量顯著</p><p>　　提高（P<0.05）。</p><p>　　結(jié)論：試驗(yàn)一：經(jīng)過(guò)選育，確定了一株產(chǎn)酸性能較好的嗜酸乳桿菌 S5。試驗(yàn)二：確定發(fā)酵產(chǎn)物中乳 酸含量最優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)為，溫度：37℃、時(shí)間：48 h 、底物初水分：30%、初始pH：6 、底料組成： 棉粕：玉米 = 9 ：1 ；接種量：50 mL/kg。試驗(yàn)三：發(fā)酵產(chǎn)物中的有機(jī)酸、 B 族維生素和游

16、離氨基酸</p><p>　　的含量因菌種而異，其中菌種 S5發(fā)酵產(chǎn)物中的有機(jī)酸、 B 族維生素和游離氨基酸含量得到了明顯提</p><p>　　高。試驗(yàn)四：肉仔雞的日糧中添加嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕能提高肉雞的生長(zhǎng)性能、血液理化指標(biāo)及其</p><p><b>　　III</b></p><p><b>　　免疫性

17、能。</b></p><p>　　關(guān)鍵詞：嗜酸乳桿菌；固體發(fā)酵；發(fā)酵棉粕；雞血清；代謝產(chǎn)物</p><p>　　論文類(lèi)型： B（應(yīng)用研究）</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Objective: Lactobacillus acidophilus was selecte

18、d as starting strain in this study, screening out</p><p>　　Lactobacillus acidophilus with properties of high-yield acid, through the optimization of fermentation</p><p><b>　　IV</b>&l

19、t;/p><p>　　condition parameters, bottom material composition, inoculation amount of the selected breeding strains with cottonseed meal and corn as solid fermentation substrate to explore the metabolic component

20、s and nutritional value of fermentation products of the breeding Lactobacillus acidophilus strains, and the effects on growth performance, blood physical and chemical indicators and immune indexes of broiler chicken, the

21、refore providing theoretical support for the comprehensive assessment and rationa</p><p>　　Method: This research is composed by four parts. Experiment 1: Choose a good strain with higher acid produce and bet

22、ter growth through S1, W2 and J2 Lactobacillus acidophilus, and identify it as Lactobacillus acidophilus. Experiment 2: In order to optimize biology forage fermentation parameters of Lactobacillus acidophilus, 4 factors

23、5 levels orthogonal and two factors with repeated observed value design method were combined through the lactic acid content of ferment substrate to determine ferme</p><p>　　Results: Experiment 1: Acid produ

24、ct amount of S5 strain reached 2.14g/L after fostering for 36h, through physiology and biochemistry identification and 16SDNA complete sequence analytical method to ascertain its species, and then confirm homologous gene

25、 by Gene Bank comparison, use DNAMAN software to draw phylogenetic tree, and identify it as Lactobacillus acidophilus. Experiment 2: The optimized fermentation conditions parameters of Lactobacillus acidophilus biology f

26、orage are as follows: ferme</p><p><b>　　V</b></p><p>　　average daily food consumption and average daily gain significantly increased 10.20%and 15.41%( P<0.05), forage weight propo

27、rtion decreased 4.63% (P>0.05); (2) in 0~21-day-old, albumin and total protein significantly increased 10.64% and 5.68% (P <0.05), Ca and P improved 7.31% and 11.62%, but the difference is not significant (P>0.0

28、5), triglyceride significantly increased 23.73% (P<0.05), total cholesterol significantly decreased 6.72% ( P<0.05); (3) in 21~42-day-old, albumin improved2.86%, but</p><p>　　Conclusions: Experiment 1:

29、 Selected and breed a strain Lactobacillus acidophilus S5 with better acid production. Experiment 2: Ascertained the optimal biological fermentation forage parameters for acid production of fermentation metabolite, tempe

30、rature is 37℃, fermentation time cycle is 48h, initial moisture of the substrate is 30% and pH 6; The optimized bottom material composition is 90% cottonseed meal and 10% corn, inoculation amount is 50 mL /kg. Experiment

31、 3: Organic acid, Vitamin B and fr</p><p>　　Key words: Lactobacillus acidophilus; solid fermentation; fermentation cottonseed meal; chicken serum;</p><p>　　metabolites</p><p><b&

32、gt;　　主要縮略詞</b></p><p>　　Main Abbreviation</p><p>　　英文縮寫(xiě) 英文全稱(chēng)中文全稱(chēng)</p><p><b>　　VI</b></p><p><b>　　VII</b></p><p><b>　　

33、VIII</b></p><p><b>　　IX</b></p><p><b>　　作者簡(jiǎn)介38</b></p><p>　　石河子大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評(píng)閱表39</p><p><b>　　前 言</b></p><p>&l

34、t;b>　　1 研究目的及意義</b></p><p>　　近年來(lái)，隨著畜禽集約化飼養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展和飼養(yǎng)密度的增加，各種畜禽疾病的發(fā) 生越來(lái)越頻繁，為此在飼料中加入各種抗生素類(lèi)藥物已經(jīng)比較普遍，且使用量越來(lái)越大。 抗生素在消滅致病菌的同時(shí)，也消滅了對(duì)動(dòng)物機(jī)體有益的細(xì)菌，破壞腸道微生物的微生 態(tài)平衡，導(dǎo)致動(dòng)物（特別是幼年畜禽）對(duì)病原微生物的易感性。這不僅使病原微生物產(chǎn) 生了嚴(yán)重的抗藥性，而且導(dǎo)致畜

35、產(chǎn)品藥物殘留增加，嚴(yán)重影響人們的身體健康和畜產(chǎn)品</p><p><b>　　X</b></p><p>　　國(guó)際貿(mào)易。那么，如何才能在盡量減少抗生素類(lèi)藥物使用的同時(shí)，維護(hù)動(dòng)物健康呢？近 年來(lái)最引人注目的是以微生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的微生物技術(shù)，研究較多是乳酸菌，因?yàn)槿樗峋?屬于腸道的正常菌群，用其發(fā)酵飼料后，發(fā)酵飼料中含有相當(dāng)數(shù)量的活菌。乳酸是其主 要的代謝產(chǎn)物，可作為畜禽的

36、生長(zhǎng)促進(jìn)劑，能夠調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡、補(bǔ)充有益菌、 調(diào)節(jié)腸道的 pH、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、增強(qiáng)免疫力、合成多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的新 陳代謝，并起到活化消化酶、改善氨 基酸吸收等作用。因此，選育出一株高產(chǎn)乳酸的嗜 酸乳桿菌對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，本研究采用微生物篩選技術(shù)，選育出一 株具有高產(chǎn)酸性能的嗜酸乳桿菌（L.acidophilus），通過(guò)發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化等試驗(yàn)，就 嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕的營(yíng)養(yǎng)特性進(jìn)行了研究。為微生物發(fā)酵飼料

37、在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用和 持續(xù)發(fā)展提供理論參考。</p><p><b>　　2 立題依據(jù)</b></p><p>　　微生物發(fā)酵飼料的關(guān)鍵之處在于菌種的選擇，目前廣泛用于發(fā)酵飼料的菌種有乳酸 菌、霉菌、酵母菌、芽孢桿菌等，而乳酸桿菌是人和動(dòng)物腸道的正常定居者，在腸道內(nèi) 生長(zhǎng)發(fā)育，分解糖類(lèi)生成乳酸而形成酸性環(huán)境，從而抑制腸道內(nèi)有害細(xì)菌的增殖，并防 止產(chǎn)毒和致病。此外，乳酸

38、桿菌可產(chǎn)生過(guò)氧化氫、雙乙酰和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制或 殺滅假單孢菌屬、大腸桿菌類(lèi)和沙門(mén)氏菌屬；通過(guò)特異性和非特異性免疫應(yīng)答途徑來(lái)增 強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力。乳酸桿菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有重要的營(yíng)養(yǎng)作用，能夠分解飼料中的糖類(lèi)、 脂肪和蛋白質(zhì)，可合成維生素，產(chǎn)生宿主可利用的有機(jī)酸、必需氨基酸等代謝產(chǎn)物，從 而增強(qiáng)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝，改善生產(chǎn)性能。</p><p>　　目前乳酸菌的研究主要集中在微生態(tài)制劑（Kimoto H，2004）、

39、益生功能（Jasna M， 2009；Caramia G，2009）、益生作用機(jī)制（ Suzuki C，2008）等方面，而棉粕的研究主 要集中在發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化、棉酚脫毒菌種的篩選、發(fā)酵前后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的變化等 方面（魏二虹，2010；楊繼良等，2000；張文舉等，2006）。目前主要用于研究的微生 物菌種有酵母菌、熱帶假絲酵母及霉菌等（吳小月等， 1989；施安輝等，1993），但是 關(guān)于嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕源蛋白質(zhì)飼料的營(yíng)養(yǎng)特性需

40、進(jìn)一步研究，尤其是發(fā)酵底物中有 機(jī)酸、B 族維生素等代謝產(chǎn)物的變化。</p><p>　　3 論文總體研究思路</p><p>　　本論文擬從以下幾個(gè)方面開(kāi)展試驗(yàn)： （1）試驗(yàn)以乳酸產(chǎn)量為指標(biāo)，擬通過(guò)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸的含量和 pH 值，從三種</p><p>　　嗜酸乳桿菌中選育出一株高產(chǎn)乳酸的菌株，確定一株菌株后，再通過(guò)平板反復(fù)培養(yǎng)選育 出一株產(chǎn)酸高的菌株，并測(cè)

41、其 DNA 全序列鑒定該菌種，為后續(xù)嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕試 驗(yàn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。</p><p>　　(2) 試驗(yàn)的發(fā)酵底物為棉粕和玉米混合物，對(duì)高產(chǎn)乳酸的嗜酸乳桿菌發(fā)酵條件參數(shù)、 底物組成比例和接種量進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，利用高產(chǎn)乳酸菌株對(duì)棉粕玉米混合底 物進(jìn)行發(fā)酵，采用液相色譜- 質(zhì)譜（LC-MS/MS）、離子色譜等技術(shù)平臺(tái)對(duì)其發(fā)酵底物中</p><p><b>　　XI<

42、/b></p><p>　　族維生素、游離氨基酸和有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。 </p><p>　　在飼糧中添加嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕飼喂 AA 肉雞，研究其對(duì) AA 肉仔雞生長(zhǎng)性 能、血液理化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響。 </p><p>　　通過(guò)以上試驗(yàn)，選育出一株高產(chǎn)乳酸的嗜酸乳桿菌，進(jìn)行發(fā)酵棉粕的條件參數(shù)、底 物組成比例、接種量的優(yōu)化，對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕底物中

43、營(yíng)養(yǎng)特性進(jìn)行研究，并在飼 糧中添加發(fā)酵飼料飼喂 AA 肉仔雞，探究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、血液理化指標(biāo)和免疫指標(biāo) 的影響。本研究為棉粕發(fā)酵飼料的科學(xué)評(píng)定和合理利用提供理論依據(jù)。 </p><p><b>　　第一章 文獻(xiàn)綜述</b></p><p>　　乳酸菌的研究進(jìn)展及微生物發(fā)酵棉粕在畜禽中的應(yīng)用</p><p>　　1 乳酸菌的分類(lèi)、培養(yǎng)及其保

44、存</p><p>　　1.1 乳酸菌的分類(lèi)</p><p>　　乳酸菌屬于真細(xì)菌綱(Eubacteriac)真細(xì)菌目(Eubacteriales)中的乳酸細(xì)菌科</p><p>　　(Lactobacillaceae)。從形態(tài)上可分為球菌和桿菌；呈球形的菌有鏈球菌、片球菌及明串</p><p>　　珠菌屬；呈桿狀的菌有乳桿菌(Lactoba

45、cillus) 、乳球菌(Lactococcus)和雙歧桿菌</p><p>　　(Bifidobacterium)等至少23個(gè)屬。根據(jù)生長(zhǎng)溫度的不同，可將乳酸菌分為高溫型和中溫型 2類(lèi)。根據(jù)發(fā)酵類(lèi)型不同，可以分為同型發(fā)酵(發(fā)酵產(chǎn)物中僅有乳酸)和異型發(fā)酵（發(fā)酵產(chǎn) 物除乳酸外，還有乙酸、乙醇和香味成分等）。</p><p>　　1.2 乳酸菌的培養(yǎng)</p><p>　

46、　乳酸菌有特殊且復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)要求，為了滿(mǎn)足乳酸菌的正常生長(zhǎng)需要，培養(yǎng)基需要提</p><p><b>　　XII</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　供碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、類(lèi)外，還需要補(bǔ)充維生素、氨基酸、肽等。山麗杰、田洪濤和 賈英民等[1]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)乳酸桿菌通常使用的培養(yǎng)基是脫脂乳、乳

47、清基礎(chǔ)培養(yǎng)基和MRS 培養(yǎng)基。湯保貴、歐柱榮和徐中文等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌生長(zhǎng)的最適pH值為6.5～7.0。不同 的乳酸菌，對(duì)最適溫度要求不同，高溫型的最適溫度為37℃，中溫型的最適溫度為25～ 30℃，一般采用恒溫厭氧培養(yǎng)即采用95％氮?dú)夂?％二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)為宜[2]。</p><p>　　1.3 乳酸菌的保存</p><p>　　乳酸菌在保存的過(guò)程中，由于它的代謝產(chǎn)物中含有乳酸導(dǎo)致培

48、養(yǎng)基的pH下降，造成 乳酸菌的死亡。所以在乳酸菌保藏過(guò)程中，要不斷的進(jìn)行傳代移種。目前，乳酸菌菌種 保藏方法大致可分為傳代法、干燥法、冷凍法及冷凍干燥法四大類(lèi)，目前較為廣泛使用 且保存安全性最高的方法為冷凍干燥保存法和超低溫保存法。因?yàn)樵诔蜏乩鋬? - 196℃ 液氮)中保存可以使活細(xì)胞物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)幾乎完全停止[3]。Fonseca等（2006）研究表 明以甘油、糖類(lèi)、麥芽糊精等高黏度保護(hù)劑對(duì)乳酸菌進(jìn)行保護(hù)，在快速冷凍下的保護(hù)效 果

49、顯著，而二甲基亞砜、甲醇等因不能改變冷凍濃縮溶液結(jié)構(gòu)，保護(hù)效果比較差，很少 作為乳酸菌的冷凍保護(hù)劑[4] 。</p><p>　　2 乳酸菌的生理功能</p><p>　　2.1 維持動(dòng)物腸道菌群平衡</p><p>　　乳酸菌作為人和動(dòng)物重要優(yōu)勢(shì)菌群之一，在維持動(dòng)物腸道的菌群平衡方面起到重要 作用。因?yàn)槌跎鷦?dòng)物的消化道內(nèi)通常是無(wú)菌的，出生后由于與外界環(huán)境的接觸，而

50、建立 自己的腸道微生物體系，但此時(shí)腸道微生態(tài)系統(tǒng)剛開(kāi)始建立，如果在此時(shí)給初生動(dòng)物添 加外源的益生菌如乳酸菌，可以有效提高益生菌在動(dòng)物腸道的定植力，使其成為動(dòng)物腸 道的優(yōu)勢(shì)菌群，從而有效抑制病原菌的增殖[5] ，從而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)腸道 菌群結(jié)構(gòu)、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的作用。馬治宇研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群通常是維持動(dòng)物腸道內(nèi)微生 物生態(tài)平衡的核心因素，如果腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群含量下降或者失衡，將導(dǎo)致腸道微生態(tài) 體系的紊亂和失衡[6] 。研究發(fā)現(xiàn)乳酸

51、菌是定居在動(dòng)物腸道中的有益菌群，以乳酸菌為代 表的專(zhuān)性厭氧菌是構(gòu)成定植抗力的主要力量即指宿主對(duì)致病菌與潛在致病菌在正常微 生物群中定植和繁殖的阻抗力[7]。研究表明，來(lái)源于宿主本身的菌種制劑比外源菌種制 劑對(duì)機(jī)體健康更有益[8]。因此早期補(bǔ)充乳酸菌，能使其更多的定植于腸上皮起到占位作 用和產(chǎn)生足夠多的乳酸，從而降低腸道pH，有效抑制致病菌及腐敗菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)了腸 道蠕動(dòng)，維持腸道微生態(tài)平衡和正常生理功能。</p><

52、p>　　2.2 促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能分解飼料中的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能顯著提高食物 消化率和生物效價(jià)，促進(jìn)消化吸收[9]。Ozbas發(fā)現(xiàn)，乳酸菌除了能產(chǎn)生一般微生物產(chǎn)生的 酶系之外，還能產(chǎn)生它專(zhuān)屬的酶系使其具有特殊的生物學(xué)功能。如：產(chǎn)生有機(jī)酸的酶系、 分解亞硝胺的酶系、分解脂肪的酶系、合成多醣的酶系、合成各種維生素的酶系等[10] 。 乳酸菌在代謝過(guò)程中消

53、耗維生素，同時(shí)也合成維生素，如葉酸等B族維生素，其代謝過(guò) 程產(chǎn)生的有機(jī)酸會(huì)使腸內(nèi)的pH降低，同時(shí)能夠增強(qiáng)B1 、B6 和B12 的穩(wěn)定性，使Ca 、</p><p><b>　　2</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　P元素處于易吸收的離子狀態(tài)，促進(jìn)骨骼發(fā)育，并且可以防治由于缺鐵、缺鈣引

54、起的貧 血病和軟骨病等。在飼料消化代謝中，可以降解一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料的適口性， 增加家畜的采食量，提高了飼料的利用率和消化率。</p><p>　　2.3 增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力</p><p>　　乳酸菌不僅能提高激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用，而且由于它能在腸道內(nèi)定植，從而促 進(jìn)免疫器官的發(fā)育成熟、刺激宿主建立完備的免疫系統(tǒng)，完善動(dòng)物機(jī)體的天然免疫屏障。 此外，乳酸菌還能刺激腹膜巨噬細(xì)胞、促

55、進(jìn)細(xì)胞分裂、產(chǎn)生干擾素、產(chǎn)生抗體及促進(jìn)細(xì) 胞免疫等作用，從而能夠增強(qiáng)機(jī)體的非特異性和特異性免疫反應(yīng)，提高動(dòng)物機(jī)體的抗病 能力。乳酸菌能提高外周血T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞 免疫功能[11] 。杭柏林等研究表明，在基礎(chǔ)日糧中添加植物乳桿菌和糞鏈球菌均能促進(jìn) AA肉雞胸腺、脾臟和法氏囊的發(fā)育，增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬功能，增加胸腺和脾臟中的T細(xì) 胞數(shù)以及提高機(jī)體產(chǎn)生ND疫苗HI抗體的水平[12]。張凱等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可刺

56、激宿主產(chǎn) 生免疫蛋白及清除功能，增加粘膜表面和血清中IgA、IgM、IgG水平，加強(qiáng)體液免疫， 促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，活化自然殺傷細(xì)胞并產(chǎn)生免疫球蛋白[13]。Strompfova等給仔 豬日糧中添加屎腸球菌后研究表明，屎腸球菌可以顯著提高血清總蛋白、鈣、血紅蛋白、 紅細(xì)胞濃度及顆粒細(xì)胞吞噬指數(shù)(P<0.05)，提高了動(dòng)物機(jī)體的免疫能力[14]。李雪平等通 過(guò)在肉</p><p>　　2.4 產(chǎn)生具有抑

57、菌活性的代謝物</p><p>　　乳酸菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生細(xì)菌素(Bacteriocins) ，是細(xì)菌合成并分泌到環(huán)境中的一 類(lèi)對(duì)同種或親緣關(guān)系較近的種有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)，抑菌譜較廣，對(duì)多種 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素種類(lèi)較多，每一種乳酸菌都可 以產(chǎn)生一種或多種乳酸菌素。因其產(chǎn)量較低，現(xiàn)在主要集中在篩選高產(chǎn)菌株和構(gòu)建工程 菌株上。寧喜斌研究發(fā)現(xiàn)各種乳酸桿菌素和雙歧菌素，對(duì)葡萄

58、球菌、梭狀芽孢桿菌、沙 門(mén)氏菌和志賀氏菌有拮抗作用[16]。另外，雙歧桿菌等還可將結(jié)合的膽酸分解為游離的膽 酸，后者對(duì)細(xì)菌的抑制作用比前者強(qiáng)。因此，乳酸菌可以抑制病原性細(xì)菌的增殖，增加 機(jī)體的抵抗力。</p><p>　　3 乳酸菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用</p><p>　　3.1 在雞生產(chǎn)中的應(yīng)用</p><p>　　在肉雞的基礎(chǔ)日糧中添加乳酸菌制劑，可以提高肉雞的日

59、增重，提高飼料轉(zhuǎn)化率， 增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等。研究表明在日糧中添加0.02%乳酸菌劑組的平均日增重顯著高于 對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)組飼料消耗量比對(duì)照組分別低8.75%和15.62%,所以，乳酸菌制劑 可以降低料肉比[17]。Jin等報(bào)道, 肉雞飼料中添加 12 種嗜酸性乳酸菌混合制劑, 處理組 體重變化顯著(P<0.05), 飼料轉(zhuǎn)化率也有明顯的改善[18]，且給初生動(dòng)物提供乳酸菌有助 于提高腸道內(nèi)的乳酸菌含量[19]。

60、劉乃芝等通過(guò)在肉雞的日糧中添加不同水平的植物乳桿 菌，檢測(cè)不同日齡血清中總蛋白含量、IgG含量及NDV抗體效價(jià)，發(fā)現(xiàn)添加不同水平的</p><p><b>　　3</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　植物乳桿菌均有助于提高肉雞的免疫水平，且添加量在2.0～4.0時(shí)效果最好[20]。<

61、;/p><p>　　3.2 在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用</p><p>　　在豬的日糧中添加乳酸菌，可以提高豬的日增重和豬肉的品質(zhì)，降低料肉比，提高 飼料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力等。索成等通過(guò)在斷奶仔豬的飼糧中添加抗生素（乙酰 甲喹）和植物乳桿菌，結(jié)果表明當(dāng)在基礎(chǔ)日糧中加入1× 109 cfu/mL 植物乳桿菌ZJ316時(shí)， 仔豬的日增重較對(duì)照組提高了20.45%（P<0.05），飼料轉(zhuǎn)

62、化率較對(duì)照組提高了21.95% （P<0.05），料肉比減少了19.18%（P <0.05），且死亡率和仔豬腹瀉率均有所下降，肉 的品質(zhì)也有所提高[21]。在斷奶仔豬日糧中通過(guò)添加乳酸菌等有益菌,使仔豬腸道內(nèi)乳酸 菌大量繁殖而抑制有害菌生長(zhǎng)，提高機(jī)體的抗病力，降低斷奶仔豬腹瀉率等[22]。</p><p>　　3.3 在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用</p><p>　　在幼齡反芻動(dòng)物的

63、飼養(yǎng)過(guò)程中使用乳酸菌制劑，有助于幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育， 提高日增重，調(diào)節(jié)瘤胃的pH，有助于反芻動(dòng)物的腸道微生物的菌群平衡等有力作用[23]。 帥麗芳等（2002）給荷斯坦奶牛飼喂含乳酸菌的發(fā)酵乳，發(fā)現(xiàn)其反芻時(shí)間得到顯著提高 [24]。通過(guò)給新生犢牛口服假長(zhǎng)形雙歧桿菌，研究結(jié)果表明其增重提高了25.2 %，飼料轉(zhuǎn) 化率提高了11.4 %[25] 。Weinberg等通過(guò)體外試驗(yàn)表明，當(dāng)乳酸菌和青貯飼料一起被反芻 動(dòng)物采食后，乳酸菌可以在

64、瘤胃中存活，并且影響著瘤胃的微生物菌群，進(jìn)而影響著消 化道上皮組織，增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，且對(duì)家畜的生長(zhǎng)性能和生理形態(tài)也有所影 響[26] 。侯新強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，在青貯飼料中添加乳酸菌，可以顯著提高牛羊的體重，奶 產(chǎn)量可以提高到18.2%，也可以降低瘤胃的pH值，粗飼料等可以得到更好的消化吸收[27]。</p><p>　　3.4 在水產(chǎn)中的應(yīng)用</p><p>　　乳酸菌常作為一種添加

65、劑應(yīng)用于飼料中，動(dòng)物機(jī)體食用后，會(huì)在動(dòng)物的體內(nèi)定值， 并且能分解多種酶類(lèi)如蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶等。朱學(xué)芝等研究發(fā)現(xiàn)乳酸 菌的代謝產(chǎn)物能協(xié)助蝦消化一些不易消化代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)蝦對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸 收，提高飼料的轉(zhuǎn)化率[28]。研究發(fā)現(xiàn)，在黑鯛的仔魚(yú)發(fā)育階段使用乳酸菌和在仔魚(yú)的餌 料中及在活水中使用乳酸菌，能夠提高仔魚(yú)的消化酶活力和生長(zhǎng)性能，且效果顯著[29]。 Son等通過(guò)在石斑魚(yú)飼料中添加植物乳桿菌，經(jīng)過(guò)4周的飼喂，結(jié)果

66、表明，能夠顯著提高 石斑魚(yú)飼料利用率和增重速度[30] 。因此，乳酸菌在水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)應(yīng)用中有很大的發(fā) 展前景。</p><p>　　4 微生物育種方法及微生物發(fā)酵棉粕的研究進(jìn)展</p><p>　　4.1 微生物育種方法的研究進(jìn)展</p><p>　　在微生物的發(fā)酵過(guò)程中，為了得到某一目的代謝產(chǎn)物，改善菌種的某一特性，提高 其產(chǎn)量，獲得新菌種或新的代謝產(chǎn)物等，人們

67、有目的的去改變菌種某一些特性，解決實(shí) 際生產(chǎn)需要。目前的育種方法主要有自然選擇方法、物理誘變方法和化學(xué)誘變方法等[31]。</p><p>　　自然選擇的方法是指不經(jīng)過(guò)人工處理，從分離培養(yǎng)基上選取生長(zhǎng)特性較好的單個(gè)菌 落，進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)等。物理誘變是指使用物理方法對(duì)菌種進(jìn)行處理以便獲得正向突變的 菌株，處理方法主要有紫外線、激光、X射線、射線、 射線及離子束等處理。而化學(xué)</p><p>&

68、lt;b>　　4</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　誘變主要是指通過(guò)化學(xué)方法改變微生物的某一性狀的方法，主要是通過(guò)與其DNA起作 用，主要有堿基類(lèi)似物、烷基化、移碼突變劑等。徐子鈞等使用亞硝基胍、紫外線、DES 等結(jié)合的方式對(duì)乳酸菌進(jìn)行復(fù)合誘變育種，利用高濃乳酸鈣平板選育出耐酸的菌株，以 便獲得正向的突變菌株，利

69、用純?nèi)樗崞桨暹x育出不分解利用乳酸的菌株，然后利用琥珀 酸平板選出強(qiáng)化TCA減弱途徑的菌株，從而獲得一株高產(chǎn)L(+)-乳酸的正向突變株M7， 平均發(fā)酵產(chǎn)量為90 g/L，相對(duì)原菌株的乳酸產(chǎn)量增加了30%，而糖轉(zhuǎn)化達(dá)到了88.9%的轉(zhuǎn) 化率[32]。李小平等利用UV對(duì)保加利亞乳桿菌進(jìn)行誘變處理，以其獲得高產(chǎn)乳酸的菌株， 結(jié)果表明，當(dāng)紫外線的照射距離為26.5 cm，照射時(shí)間為60 s ，出發(fā)菌稀釋到10- 6時(shí)，發(fā) 酵36 h后，得到的突變

70、菌株的產(chǎn)酸量為16.1 g/L，此時(shí)可獲得最大產(chǎn)酸量，培養(yǎng)12 h時(shí)， 產(chǎn)酸量較出發(fā)菌株增加了56.6%[33]。馬春麗等利用UV和亞硝基對(duì)Lactobacillus bulgaricus B -3菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，當(dāng)用0.3 g/L亞硝基胍處理60 min和紫外線照射120 s 復(fù)合處理誘 變3</p><p>　　4.2 微生物發(fā)酵棉粕的研究進(jìn)展</p><p>　　棉籽餅粕是棉花加工

71、過(guò)程中的副產(chǎn)品，通常其蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)到40%左右，是 我國(guó)重要的植物蛋白質(zhì)飼料資源，因棉籽餅粕中含有害物質(zhì)危及著動(dòng)物健康，所以限制 棉粕在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用。所以利用微生物發(fā)酵棉粕，不僅可以降解其中的有害物質(zhì)游 離棉酚（free gossypol ， FG），而且可以提高飼料的蛋白質(zhì)含量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。</p><p>　　棉粕發(fā)酵工藝參數(shù)主要包括發(fā)酵底物組成、接種比例、接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間等。 聶蓬勃等使用經(jīng)過(guò)

72、篩選的脫毒菌株B2對(duì)進(jìn)行棉粕的發(fā)酵，試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株B2對(duì)棉 粕脫毒的最優(yōu)發(fā)酵條件如下:接種量是2%，發(fā)酵時(shí)間是48 h，料水比為1:1，溫度是28℃， 自然pH值，這樣游離棉酚可達(dá)到最大降解率為51.7%[35] 。馮莉等利用熱帶假絲酵母和 釀酒酵母對(duì)棉粕進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，采用二因子用重復(fù)的方法進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)研究接種比例和接 種量，結(jié)果表明，兩種菌種復(fù)合發(fā)酵棉粕源蛋白質(zhì)飼料的優(yōu)化條件為，熱帶假絲酵母和 釀酒酵母的接種比例為3:7，接種量為8

73、0 mL/Kg，發(fā)酵時(shí)間為48 h，底物水分了40%，發(fā) 酵溫度為32℃，自然pH[36] 。朱德偉等通過(guò)從醋酸棉酚YPG培養(yǎng)基中進(jìn)行反復(fù)篩選，利 用復(fù)合發(fā)酵的方法，得到一株高效降解棉酚的菌株（熱帶假絲酵母JD-9），利用單因素 試驗(yàn)方法研究其脫毒的工藝，并確定熱帶假絲酵母JD-9及卡式酵母JD-13的接種量，試 驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卡式酵母JD-13的接種量為0.56%，熱帶假絲酵母JD-9的接種量為4.42%， 發(fā)酵時(shí)間為48 h，料水比為

74、1:0.8，發(fā)酵溫度為30℃</p><p>　　微生物發(fā)酵棉粕菌株篩選與脫毒效果的研究主要是為了脫去棉粕中的有害物質(zhì)-游 離棉酚，降解棉酚的主要方法有化學(xué)藥劑添加法、物理法、混合溶劑浸提等方法，80年 代末期，我國(guó)開(kāi)始利用微生物發(fā)酵的方法來(lái)脫毒，該法不僅降解了棉籽餅粕中的棉酚， 同時(shí)也提高了發(fā)酵底物中的蛋白質(zhì)含量，也縮小了成本，提高了棉籽餅粕的利用價(jià)值。 鐘英長(zhǎng)等在1990年和1993年獲得了棉籽餅的微生物脫毒

75、方法的專(zhuān)利，他利用自然界中耐 受棉酚的曲霉菌種發(fā)酵棉籽餅粕，使棉酚的降解率達(dá)到了60%-75%左右，并且CP和氨基</p><p><b>　　5</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　酸含量均有所提高[38，39]。吳小月等在1989年從真菌、細(xì)菌和酵母菌等12種微生物中篩選 出了3種微

76、生物具有較強(qiáng)的降解棉酚能力，能夠使棉酚的降解率達(dá)到90%左右，但是發(fā) 酵時(shí)間較長(zhǎng)，需要72 h-96 h[40]。施安輝等在1991年發(fā)現(xiàn)了曲霉、假絲酵母、球擬酵母具 有很強(qiáng)的脫毒能力，但仍需72 h的發(fā)酵時(shí)間[41]。魏二虹等通過(guò)對(duì)熱帶假絲酵母菌ZD-3與 釀酒酵母菌ZD-5、熱帶假絲酵母菌ZD-3與黑曲霉ZD-8的研究，通過(guò)采用不同的添加比 例，對(duì)棉籽餅底物進(jìn)行二元復(fù)合發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZD-3與ZD-5的脫毒效果要高于ZD-3 與Z

77、D-8，且當(dāng)ZD-3和ZD-5接種比例為3:1時(shí)，脫毒率可高達(dá)90.82%以上[42]。</p><p>　　微生物發(fā)酵飼料不僅能夠提高飼料的品質(zhì)，還能夠提高飼料的消化利用效率，同時(shí) 也提高了飼料蛋白質(zhì)含量的水平，還能夠增加發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的各種消化酶、氨基酸、 有機(jī)酸、多肽、小肽、維生素等的含量，且能夠培養(yǎng)出大量的微生物活菌，不僅能夠防 病抑菌，還能夠增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力，節(jié)約了大量的成本。如今，微生物發(fā)酵棉粕主

78、 要應(yīng)用在豬、家禽、水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)之中等，微生物發(fā)酵棉粕可以代替豆粕發(fā)揮蛋白質(zhì) 飼料的作用。</p><p>　　金紅春等利用復(fù)合芽孢桿菌發(fā)酵棉粕，發(fā)酵底物為棉粕/麥麩為90/10，研究其發(fā)酵 前后的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵底物中的粗蛋白較發(fā)酵前提高了6.99%，脂肪酶 活力、淀粉酶活力分別提高了299 U/g、766 U/g[43]。張文舉等利用熱帶假絲酵母ZD-3和 黑曲霉ZD-8以棉粕為發(fā)酵底物進(jìn)行復(fù)合

79、發(fā)酵，探究其發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生的變化，研 究發(fā)現(xiàn)，棉粕發(fā)酵后較發(fā)酵前，粗蛋白提高了27.83%，總氨基酸提高了18.15%，必需氨 基酸提高了19.18%，其中蛋氨酸、精氨酸分別提高了66.29%、6.40%，且總氨基酸、必 需氨基酸、粗蛋白的體外消化率分別提高了26.16%、20.90%、24.47%，說(shuō)明熱帶假絲酵 母ZD-3和黑曲霉ZD-8復(fù)合發(fā)酵棉粕，可以提高和改善棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[44]。</p><p&g

80、t;　　4.3 微生物發(fā)酵飼料在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用</p><p>　　微生物發(fā)酵飼料不僅能夠提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還能使發(fā)酵飼料具有獨(dú)特的香味， 增加飼料的適口性，提高家畜的采食量。微生物在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的各種消化酶， 促進(jìn)了動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收，并且增強(qiáng)了機(jī)體的抗病能力。</p><p>　　朱立國(guó)使用全價(jià)固體發(fā)酵飼料，研究其對(duì)肉鴨生長(zhǎng)性能影響的試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試 驗(yàn)組較

81、對(duì)照組，料肉比從2.67:1降為2.49:1，平均增重提高了2.63%，成活率從96.80%提 高到99.20%[45]。孫汝江等通過(guò)在42 周齡海蘭褐蛋雞的日糧中添加不同含量的發(fā)酵飼料， 研究對(duì)其生長(zhǎng)性能的影響，在其每100 kg日糧中分別添加5 kg、10 kg、15 kg的微生物發(fā) 酵飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在蘭褐蛋雞每100 kg的日糧里添加10 kg的微生物發(fā)酵飼料后，產(chǎn)蛋 率和蛋重能得到顯著提高，料蛋比明顯下降3.46%，蛋品質(zhì)得到

82、了顯著提高，其中蛋殼 強(qiáng)度較對(duì)照組顯著提高7.33 %，哈氏單位顯著提高了6.55 %，蛋黃顏色提高了8.0%，血 清中鈣、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶分別顯著提高了8.63%、4.87%、7.23%[46]。可見(jiàn)，微 生物發(fā)酵飼料可以提高蛋雞的生長(zhǎng)性能。</p><p>　　蘆春蓮等通過(guò)在健康泌乳期的奶牛的日糧里添加酵母培養(yǎng)物，研究其對(duì)奶牛生長(zhǎng)性 能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：添加酵母培養(yǎng)物后奶牛產(chǎn)奶量、乳脂率顯著增加(P&l

83、t;0.05)[47]。嚴(yán)</p><p><b>　　6</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　昌國(guó)等通過(guò)在延邊黃牛的日糧里添加發(fā)酵飼料，研究其對(duì)體黃牛體重、體尺、血液組成、 生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果表明：添加發(fā)酵飼料后黃牛的日增重顯著提高了27.30%，料重比 顯著降低了24.60%，體高

84、、坐骨寬、胸圍、民長(zhǎng)分別提高了139.13%、77.62%、17.48%、</p><p>　　50%(P<0.01)，血清中鈣、磷、葡萄糖含量的含量分別提高了2.84%、6.15%、16.14%， 屠宰率、凈肉率分別顯著提高了8.33%、11.43%(P <0.05)，眼肌面積提高了7.02%(P<0.01)，</p><p>　　試驗(yàn)組的宰前活重、活體重、骨重、肉骨重

85、和凈肉重分別提高了6.23%、17.05%、15.05%、</p><p>　　11.59%和0.53%[48]。</p><p>　　尹清強(qiáng)等以三元雜交仔豬為研究對(duì)象，研究曲霉發(fā)酵豆粕和劣質(zhì)蛋白質(zhì)飼料（棉粕、 羽毛粉、血粉）對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果表明，當(dāng)在仔豬的日糧中添加14%的發(fā) 酵豆粕時(shí)，仔豬的日增量、飼料效率分別顯著提高了4.02%、7.36%，當(dāng)添加7%的劣質(zhì) 蛋白質(zhì)飼料于

86、仔豬的日糧中時(shí)，仔豬日增重提高了8.35%(P<0.05)，飼料效率提高7.83%， 這說(shuō)明經(jīng)微生物發(fā)酵后的豆粕和劣質(zhì)蛋白質(zhì)飼料優(yōu)于傳統(tǒng)的豆粕[49]。陳道仁等通過(guò)發(fā)酵 棉粕飼喂草魚(yú)，分別使用23%發(fā)酵棉粕替代9%豆粕和全部棉粕(15%)添加在日糧中，結(jié) 果表明，發(fā)酵棉粕的添加使魚(yú)體增重率提高到了24.52%，餌料系數(shù)下降了11.89%，血清 中LSZ活力、肝臟SOD、血清SOD活力均比對(duì)照組的含量高[50]。蔣明等利用高溫脫毒及

87、 硫酸亞鐵處理后的棉粕，以不同比例代替豆粕，研究其對(duì)尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、體組成 及血清轉(zhuǎn)氨酶活性、體內(nèi)組織游離棉酚含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)脫毒處理后的棉粕 替代2/3豆粕時(shí)，肌肉中的游離棉酚含量降低為82.43%，不同處理時(shí)，羅非魚(yú)的增長(zhǎng)率 不同，也可以降低飼料中的棉酚，降低其對(duì)魚(yú)體內(nèi)臟的傷害程度[51]。</p><p><b>　　第二章 試驗(yàn)研究</b></p><

88、;p>　　試驗(yàn)一 嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸性研究及鑒定</p><p>　　嗜酸乳桿菌是乳酸菌家族中極其重要的一員，它能夠定居在宿主腸道內(nèi)，其代謝產(chǎn) 物中含有機(jī)酸，可以降低畜禽腸道的 pH，抑制病原微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸 收，降低血清膽固醇，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力，提高家畜的生長(zhǎng)速度[52-54]。</p><p>　　乳酸菌是微生態(tài)制劑的主要菌種之一，早在 1981 年美國(guó)科學(xué)家

89、Sellars 先生就預(yù)言， 在今后若干年間，嗜酸乳桿菌的研發(fā)、研究與應(yīng)用將具有很大的發(fā)展空間和潛力。目前， 它廣泛應(yīng)用于乳品生產(chǎn)、微生態(tài)制劑和藥物制劑等，但是在飼料方面的實(shí)用化研究較為 滯后，而產(chǎn)酸能力是乳酸菌的首要特征，本研究主要研究乳酸菌的產(chǎn)酸特性，可作為飼 料開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)研究，為飼料研究提供理論基礎(chǔ)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p

90、>　　1.1 試驗(yàn)材料與儀器</p><p>　　材料：菌種為課題組初步篩選出產(chǎn)酸較高的三種嗜酸乳桿菌株 S1、W2、J2；MRS</p><p><b>　　7</b></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　瓊脂培養(yǎng)基。MRS 肉湯培養(yǎng)基（MRS 瓊脂培養(yǎng)基除去瓊脂

91、粉，均購(gòu)自青島）、溴甲酚紫 (上海)，酚酞，細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒等。</p><p>　　儀器：電子天平（BS224，上海），高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3750，日本) ，隔水式恒溫 培養(yǎng)箱(GZX-9246MBE，上海），潔凈工作臺(tái)(BJ-1CD/2CD ，上海) ，酸度計(jì)（PHSJ-3F）， 酶標(biāo)儀，PCR 儀(Biometra T1-Thermocycle,德國(guó)) ，離心機(jī)（日立 HITACHI），

92、水浴鍋， 電泳儀(DYY-8C型, 北京) ，凝膠成像系統(tǒng)（UVITEC，英國(guó)），堿式滴定管，試管，100 mL 三角瓶等。</p><p><b>　　1.2 菌種的篩選</b></p><p>　　1.2.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液 pH 和產(chǎn)酸量的測(cè)定</p><p>　　MRS液體培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)取5.6 g MRS肉湯培養(yǎng)基可配置100 m

93、L，充分溶解后分 裝與試管中，在0.056 MPa條件下，121 ℃滅菌20 min。</p><p>　　MRS斜面培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)取6.5 g MRS固體培養(yǎng)基加入100 mL蒸餾水，充分溶解 后分裝與試管中，在0.056 MPa條件下，121℃滅菌20 min。</p><p>　　MRS平板培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)取6.5 g MRS固體培養(yǎng)基可配置100 mL，在0.056 MPa條&l

94、t;/p><p>　　件下，121℃滅菌15 min，在超凈工作臺(tái)中分裝于各個(gè)平板培養(yǎng)皿之中。</p><p>　　分別從菌種 S1、W2、J2 的斜面中，各挑取一環(huán)接種于 10 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中 培養(yǎng) 18 h，制成種子培養(yǎng)液。取 0.5 mL 種子培養(yǎng)液分別接種于 10 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，置于恒溫恒濕的溫箱中 37℃培養(yǎng) 120 h，每隔 12 h 取出一個(gè)試管置

95、于 4 ℃冰箱 中待檢（每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，取其平均值）。</p><p>　　培養(yǎng)液 pH：采用酸度計(jì)直接測(cè)定培養(yǎng)液的 pH.</p><p>　　乳酸(Lac)生成量的測(cè)定[55-57]：取 10 mL 肉湯培養(yǎng)液于 150 mL 三角瓶中，加入 50 mL 蒸餾水，加入 2 滴酚酞，用 0.01 mol/L NaOH 溶液滴定至微紅。按下式計(jì)算出產(chǎn)酸量。</p>&l

96、t;p>　　乳酸（g/L）=CNaoH 譜?90.8?00/樣品毫升數(shù)?1000</p><p>　　其中 V 表示消耗的 NaoH 的體積（mL），90.08 是乳酸的摩爾質(zhì)量。 1.2.2 高產(chǎn)酸菌種的選育</p><p>　　在加入溴甲酚紫（pH 變色范圍 5.2 黃色至 6.8 紫色）的 MRS 液體培養(yǎng)基的試管中 接種三株菌中產(chǎn)酸量較高的一株菌株，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中靜置，每

97、隔 1 h 觀察試管中 顏色的變化，篩選出培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色最快的培養(yǎng)液，然后用生理鹽水進(jìn)行梯 度稀釋?zhuān)偻坎加?5 個(gè) MRS 固體培養(yǎng)基中，37℃溫箱恒溫培養(yǎng) 36 h 后，分別在 5 個(gè)平 板中選取一株生長(zhǎng)較大的菌落，接種于 MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察其顏色變化，篩取 顏色變化迅速的菌株經(jīng)梯度稀釋后再涂布于平板，選取較大菌落，接種于加入指示劑的 培養(yǎng)基中，如此培養(yǎng)，反復(fù) 5 次。最終選取高產(chǎn)酸的菌株，連續(xù)傳代 5 次，檢查

98、穩(wěn)定性。 1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定</p><p>　　選育出的高產(chǎn)酸的種子培養(yǎng)液方法同 1.2.1.1，分別用移液槍吸取 0.5 mL 種子培養(yǎng) 液置已滅菌的 10 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，一共培養(yǎng) 24 h，每隔 2 h 取出一管放置于 4℃ 冰箱中，設(shè)置三個(gè)平行。待培養(yǎng)結(jié)束，每個(gè)試管取 200 uL 加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在酶</p><p><b>　　8</b

99、></p><p>　　高產(chǎn)乳酸菌種的選育及其發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)特性的研究</p><p>　　標(biāo)儀中 600 nm 測(cè)其吸光度，同時(shí)測(cè)定空白樣[58]。</p><p>　　1.3 菌種的鑒定部分</p><p>　　1.3.1 菌種的生化鑒定</p><p>　　菌種的生長(zhǎng)與生理生化試驗(yàn)皆以培養(yǎng) 16 h 的斜面作

100、為種子培養(yǎng)基。按照《微生物分 類(lèi)學(xué)》[59]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[60] 觀察菌種的形態(tài)學(xué)，并進(jìn)行生理生化性狀實(shí)驗(yàn)， 初步鑒定菌種的屬和種。</p><p>　　1.3.2 乳酸菌 PCR 的鑒定[61-62]</p><p>　　引采用細(xì)菌 16S r DNA 擴(kuò)增通用引物， 27F:5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 1492R:5'-

101、TACGGYTACCTTGTTACGACTT-33'，擴(kuò)增片斷大小約為 1400bp，由北京六 合華大基因科技股份有限公司合成。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系 25 ?L ，包括 16.3?L 水，2.5 霯10× PCR Buffer，2.0 霯Mg2+，2.0 ?L dNTP，0.5 ?L 引物，1 ?LDNA 模版，0.2 ?L Taq</p><p>　　酶。擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性 5 mi

102、n，94 ℃變性 30 s ，59 ℃退火 20 s ，72 ℃延伸 20 s ， 循環(huán) 30 次，進(jìn)行 72 ℃后延伸 10min。</p><p>　　1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析和 PCR 產(chǎn)物的測(cè)序</p><p>　　制備1%的瓊脂糖凝膠，100 V的電壓電泳40 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。 將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物交由北京華大基因研發(fā)中心進(jìn)行DNA測(cè)序。</p&

103、gt;<p><b>　　1.4 數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　測(cè)序結(jié)果的分析從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心( NCBI) 中的 Blast 程序與 Gen Bank 中已有的 16S r DNA 序列進(jìn)行同源性分析。用 DNAMAN 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析</b></p>

104、<p>　　2.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液 pH、產(chǎn)酸量</p><p>　　菌種 S1、W2、J2 MRS 肉湯培養(yǎng)液的 pH 曲線見(jiàn)圖 1.1，乳酸含量見(jiàn)圖 1.2，從圖 1.2 中可以看出在培養(yǎng) 12 h 后，菌種 S1 的 pH 顯著下降，在 24 h 時(shí) pH 達(dá)到 3.75，同時(shí)， 隨著 pH 的降低，其乳酸產(chǎn)量在 12 h 后也明顯增多，在 36 h 產(chǎn)量達(dá)到最高為 1.99 g/L, 在 3

105、6 h～72 h，pH 和乳酸含量基本保持不變，在 72～120 h，pH 稍微的上升但不明顯， 乳酸含量也隨之降低。菌種 W2 在 0 ～24 h 內(nèi)，pH 顯著下降，降為 4.34，隨著 pH 的降 低，其乳酸含量也顯著升高為 1.33 g/L，在 24～120 h 內(nèi)，菌種 W2 的變化不明顯，其乳 酸含量也變化不明顯。菌種 J2 在培養(yǎng) 24 h 后，pH 顯著下降為 4.34，其乳酸含量顯著提 高到 1.29 g/L，在隨后的

106、培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，其 pH 和乳酸含量變化均不明顯。</p><p>　　所以，菌種 S1、W2、J2 MRS 在初始 PH 為 5.72 的肉湯培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，菌種 S 1 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其 pH 也隨之的降低的同時(shí)，乳酸的含量卻隨之升高，培養(yǎng)后期 則呈現(xiàn) pH 升高，乳酸含量降低的趨勢(shì)。菌種 W2、J2 呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，但是其趨勢(shì)變 化不明顯，而且 pH 高于菌種 S1，乳酸含量均低于 S1。因此，可以看出