基于滲濾液沉積物的甲烷氧化反硝耦合微生物學(xué)機理研究.pdf

1、長期處于高濃度有機物和高濃度氨氮脅迫下的滲濾液收集池沉積物是一種極端環(huán)境。這種特殊的生境中可能存在著特異性代謝的微生物類群，尤其是耐高濃度有機質(zhì)和氨氮的碳氮元素轉(zhuǎn)化微生物。近年來，甲烷氧化反硝化耦合(Methaneoxidationcoupledtodenitrification，MOD)過程由于其耗能少，反應(yīng)器設(shè)計簡單，受到了研究者的廣泛關(guān)注，但是其微生物學(xué)機理還未有明確定論。本研究以浙江省東陽市生活垃圾填埋場16年齡滲濾液收集池沉積

2、物(0-8cm層)為研究對象，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，詳細(xì)分析了高濃度氨氮和有機物脅迫下的滲濾液沉積物原核微生物群落結(jié)構(gòu)、組成多樣性，及其潛在的微生物代謝過程;以該滲濾液沉積物為接種體，在微好氧條件下開展了MOD污泥的富集培養(yǎng)及其甲烷氧化與反硝化耦合性能研究;并以功能基因-分子克隆技術(shù)探索了富集的MOD功能微生物群落結(jié)構(gòu)與耦合機理。研究結(jié)果對開發(fā)微生物種質(zhì)資源以及廢水生物處理新工藝具有重要的現(xiàn)實意義。研究主要結(jié)論如下:
　　 (

3、1)以東陽市垃圾填埋場16年齡滲濾液收集池沉積物（0-8cm層）為研究對象，采用PCR-分子克隆技術(shù)結(jié)合16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析闡明了滲濾液沉積物中的古菌群落結(jié)構(gòu)與組成多樣性，并發(fā)現(xiàn)滲濾液沉積物中可能存在氨氧化古菌。通過對隨機挑選的425個古菌克隆子的59個基因型系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)滲濾液沉積物中的古菌分屬廣古菌門（Euryarchaeota）和泉古菌門（Crenarchaeota）;其中屬于廣古菌門基因型45個，代表了397個古菌

4、16SrRNA基因克隆，占庫容的93.41％，與產(chǎn)甲烷古菌有較高的同源性，主要為甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和甲烷桿菌目（Methanobacteriales）產(chǎn)甲烷古菌，并以甲烷鬃菌屬(Methanosaetaspp.)為優(yōu)勢種群。14個泉古菌門基因型代表了28個古菌16SrRNA基因克隆，與環(huán)境樣品來源的序列同源性較高。泉古菌門克隆B9與Candidatus

5、‘Nitrosophaeragargensis'同源性高達(dá)98.3％。
　　 (2)細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫揭示了滲濾液沉積物中有機質(zhì)降解與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物的群落結(jié)構(gòu)。多樣性指數(shù)分析表明，滲濾液沉積物中細(xì)菌的多樣性明顯高于古菌，群落結(jié)構(gòu)也更復(fù)雜。代表313個細(xì)菌16SrRNA基因克隆的244個基因型，分屬于18個細(xì)菌分類門。厚壁菌門（Firmicute）和變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌是滲濾液沉積物的主要細(xì)

6、菌類群，分別占克隆文庫庫容的21.60％和19.20％。細(xì)菌克隆中超過50％的基因型與未培養(yǎng)微生物同源性較高。部分基因型與Genbank中已發(fā)表的序列同源性較低，在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上可能屬于新的微生物類群。α-、β-和γ-變形菌亞綱的部分基因型與化能有機營養(yǎng)型反硝化菌同源性較高，推測這些細(xì)菌在滲濾液沉積物碳氮元素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用。厚壁菌門（Firmicute）梭菌綱（Clostridia）的發(fā)酵型細(xì)菌、產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸菌等化能有機營養(yǎng)型細(xì)

7、菌能夠為產(chǎn)甲烷古菌提供H2，CO2，甲基化合物和乙酸等底物，構(gòu)成了滲濾液沉積物中的產(chǎn)甲烷菌群。氨氧化古菌和氨氮利用型細(xì)菌可能具有轉(zhuǎn)化氨氮的功能，并因此形成一個低濃度氨氮小生境，從而減輕或者避免了滲濾液沉積物中高濃度氨氮對其他微生物的抑制或毒害作用。盡管滲濾液沉積物細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)與其他文獻(xiàn)報道的滲濾液微生物群落有一定的相似性，但由于滲濾液水質(zhì)和氣候等條件的不同，滲濾液與沉積物理化性質(zhì)的差別較大，垃圾滲濾液和沉積物中的微生物群落組成與

8、結(jié)構(gòu)多樣性存在顯著性差異。
　　 (3)以東陽垃圾填埋場16年齡滲濾液收集池沉積物（0-8cm層）為接種體，甲烷為唯一外加碳源，硝酸鹽和亞硝酸鹽為電子受體，在微好氧條件下，成功富集了以革蘭氏陰性菌為主體的MOD污泥。穩(wěn)定運行階段含MOD污泥反應(yīng)器的反硝化速率為4.5mmolNL-1d-1。血清瓶活性試驗表明提高反應(yīng)器配水溶解氧可顯著促進富集污泥的反硝化活性，首次證實了反應(yīng)器中配水硝酸鹽與亞硝酸鹽的還原是由于好氧反硝化微生物的作用

9、。富集培養(yǎng)與活性試驗水質(zhì)GC-MS分析結(jié)果表明，甲醛、檸檬酸鹽和乙酸鹽是甲烷氧化代謝過程形成的主要有機物。
　　 (4)以甲烷氧化功能基因pmoA和反硝化功能基因nirK分子克隆結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)為研究手段，考察了富集培養(yǎng)的MOD污泥功能微生物群落結(jié)構(gòu)及其基因豐度。結(jié)果表明，富集的MOD污泥中存在大量的甲烷氧化菌和反硝化細(xì)菌，甲烷氧化pmoA基因拷貝數(shù)約為反硝化nirK基因拷貝數(shù)的3倍。屬于γ-變形菌亞綱（Gammaprot

10、eobacteria）甲基球菌科（Methylococcaceae）的TypeⅠ型甲烷氧化菌是富集培養(yǎng)MOD污泥優(yōu)勢的甲烷氧化菌群，占總細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫庫容的37.50％，并以甲基桿菌屬（Methylobacterspp.）和甲基暖菌屬（Methylocaldumspp.）為優(yōu)勢種群;β-變形菌亞綱（Betaproteobacteria）嗜甲基菌科（Methylophilaceae）的甲基營養(yǎng)型好氧反硝化菌是該富集污泥的主

11、要反硝化微生物類群，占總細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫庫容的36.76％。
　　 綜上所述，本研究采用功能基因結(jié)合分子克隆技術(shù)首次闡明了MOD微生物學(xué)機理:TypeⅠ型的γ-變形菌亞綱（Gammaproteobacteria）甲基球菌科（Methylococcaceae）甲基桿菌屬（Methylobacterspp.）和甲基暖菌屬（Methylocaldumspp.）的甲烷氧化菌氧化甲烷，并采用5-磷酸核酮糖途徑(RuMPPat