罹病莖瘤芥PR-4蛋白基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá)分析.pdf

1、十字花科植物根腫病是由蕓薹根腫菌Plasmodiophora brasicae侵染引起的一種世界性病害。榨菜原料作物莖瘤芥Brassica juncea var. tumida Tsen受到根腫病的嚴(yán)重危害，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)根腫病的研究?jī)H側(cè)重于對(duì)根腫病的防治和發(fā)病規(guī)律的初步研究。研究根腫病菌和宿主莖瘤芥之間的互作關(guān)系，探明植物抵抗病原物的機(jī)制成為有效病害防治的必要基礎(chǔ)工作。病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis relat

2、ed proteins, PRP/PRs）是植物在病原菌刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生的與病程進(jìn)展相關(guān)的蛋白，其中一些為抗病相關(guān)蛋白。PRs基因分成17類,即PR1至PR17。當(dāng)病原菌侵染的植物后，經(jīng)過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)激活抗病反應(yīng)。PR4家族即第四類病程相關(guān)蛋白，主要組成是低分子量為13-20 kD的酸性蛋白質(zhì)。這類蛋白已確定存在于單子葉植物和雙子葉植物，已有的研究顯示，PR4蛋白具有廣泛的抗菌活性。
　　本研究通過(guò)克隆莖瘤芥中PR4蛋白基因并分析其生

3、物信息學(xué)特征；研究PR4在根腫病病程中及水楊酸，茉莉酸甲酯等內(nèi)源信號(hào)分子誘導(dǎo)下的表達(dá)特征，以探討該基因在抗莖瘤芥根腫病中作用以及信號(hào)分子對(duì)其調(diào)控作用，為將來(lái)根腫病的防治奠定基礎(chǔ)。研究所獲得的主要研究成果如下。
　　1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已建立的蕓薹根腫菌侵染莖瘤芥差減文庫(kù)，從上調(diào)表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選EST序列，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RACE技術(shù)獲得了莖瘤芥PR4蛋白基因全長(zhǎng)序列，命名為BjPR4。該基因全長(zhǎng)為584 bp，最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?23b

4、p，編碼140個(gè)氨基酸的蛋白，其理論分子量約為15.5 kD，等電點(diǎn)為8.13。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示PR4家族蛋白具有很高的同源性，BjPR4為PR4家族成員?；蛐蛄行畔⒁焉蟼鞯紾enBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為JX467703。
　　2.根據(jù)BjPR4核苷酸序列以生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽和磷酸化位點(diǎn)等蛋白質(zhì)性質(zhì)分析。預(yù)測(cè) BjPR4編碼的蛋白質(zhì)含有保守的BARWIN結(jié)構(gòu)域和N端信號(hào)肽，

5、這是Barwin家族蛋白的典型特征，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，BjPR4和其他單子葉植物一樣，不含有N末端的幾丁質(zhì)結(jié)合域，所以屬于II類PR4蛋白。
　　3.采用RT-qPCR檢測(cè)莖瘤芥植株受P. brasica侵染后，植株中BjPR4的表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果顯示莖瘤芥植株受P. brasica侵染后，BjPR4明顯的被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，并且與病程發(fā)展一致，侵染初期表達(dá)量較低，待后期根腫塊大量出現(xiàn)時(shí)BjPR4表達(dá)量急劇上升，表明莖瘤芥 PR4基因

6、與根腫病病程相關(guān)；但初期表達(dá)量較低而到嚴(yán)重發(fā)病時(shí)表達(dá)量劇增，說(shuō)明其參與植物的抗病反應(yīng)，但不能有效控制根腫病的發(fā)生。以水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、乙烯利(ET)、茉莉酸甲酯(MeJA)等常見(jiàn)植物信號(hào)因子處理莖瘤芥植株，再以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BjPR4基因的表達(dá)，結(jié)果顯示SA處理后BjPR4基因在12h時(shí)急速上調(diào)表達(dá)，但隨后急劇下降至低水平，表明BjPR4特異地受到SA誘導(dǎo)，但這種誘導(dǎo)作用不能持久。對(duì)莖瘤芥施加MeJA和ETH都抑