畢業(yè)設(shè)計(jì)論文微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究

1、<p>　　微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究</p><p>　　摘要：微核是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu),他是各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥物對分裂細(xì)胞作用的結(jié)果。一般認(rèn)為微核是起源于落后染色體與喪失著絲粒的斷片，在有絲分裂末期形成。但是另一些實(shí)驗(yàn)則表明間期細(xì)胞也可形成微核。本課題通過體外培養(yǎng)人的外周血淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞周期的特定時(shí)期注射環(huán)磷酰胺20ug/ml，觀察淋巴細(xì)胞微核形成與細(xì)胞周期的關(guān)系;實(shí)驗(yàn)結(jié)

2、果證實(shí)了細(xì)胞周期的各時(shí)期都可能有微核形成。</p><p>　　關(guān)鍵詞：環(huán)磷酰胺；淋巴細(xì)胞；細(xì)胞周期; 微核</p><p>　　Abstract:Micronucleus are the abnormal structure, which usually are the result of all kinds of physical-chemically factors such as

3、radiation，chemical medicine to mitotic cells. Micronucleus is generally believed that behind the origin and loss of centromere chromosome fragment, formed in late mitosis. However, while some other experiments on cells t

4、hat can form between the micronucleus.. This topic through in vitro of peripheral blood lymphocyte, In the cell cycle of specific period 20ug/ml cycl</p><p>　　Key Words: Cyclophosphamide; Lymphocytes; Cell c

5、ycle ；Micronucleus.</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要………………………………………………………………………………4</p><p>　　關(guān)鍵詞…………………………………………………………………………4</p><p>　　Abstract…………………………………

6、………………………………………4</p><p>　　Key words………………………………………………………………………5</p><p>　　1. 選題背景……………………………………………………………………5</p><p>　　1.1 課題來源…………………………………………………………………………5</p><p>　　1.

7、2 國內(nèi)外的相關(guān)研究……………………………………………………………5</p><p>　　1.3 目的和意義………………………………………………………………………8</p><p>　　1.4 課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)思想……………………………………………………………8</p><p>　　2. 方案論證……………………………………………………………………8</p&g

8、t;<p>　　2.1方案的設(shè)計(jì)原理………………………………………………8</p><p>　　2.2 方案論證……………………………………………………9</p><p>　　3. 材料與方法…………………………………………………………………10</p><p>　　3.1 材料與儀器……………………………………………………………………10</

9、p><p>　　3.2 實(shí)驗(yàn)步驟…………………………………………………………………………11</p><p>　　4. 結(jié)果與討論…………………………………………………………………14</p><p>　　4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果…………………………………………………………………………14</p><p>　　4.2 結(jié)果與分析………………………………

10、……………………………………17</p><p>　　5. 結(jié)論與心得…………………………………………………………………17</p><p>　　5.1 結(jié)論………………………………………………………………………………17</p><p>　　5.2 心得………………………………………………………………………………17</p><p>　　

11、參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………20</p><p><b>　　選題背景</b></p><p><b>　　課題來源</b></p><p>　　生命科學(xué)學(xué)院 王洪振老師</p><p><b>　　國內(nèi)外的相關(guān)研究</b></p>

12、;<p>　　1.2.1微核的研究狀況</p><p>　　微核是指位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小于主核1／3，主要由外界損害因素(生物、物理、化學(xué))作用細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個(gè)或數(shù)個(gè)小核[1]。因此，微核試驗(yàn)在對外來化合物(如藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境污染物等)遺傳毒性和職業(yè)暴露人群遺傳損害監(jiān)測和現(xiàn)場生態(tài)環(huán)境檢測方面，在診

13、斷和預(yù)防肝癌、食管癌、肺癌等惡性腫瘤方面得到了大量的應(yīng)用。微核試驗(yàn)最大的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、簡單、快速，而國內(nèi)外大量的對比試驗(yàn)研究，比較一致的看法是該方法在敏感性、特異性和準(zhǔn)確性方面，與經(jīng)典的染色體畸變分析方法基本相當(dāng)[2]。因而，特別適合作為大量化合物和現(xiàn)場人群初篩的實(shí)驗(yàn)方法。</p><p>　　微核試驗(yàn)創(chuàng)建于20世紀(jì)70年代中期(1973～1975)[3,4]，目前許多國家和國際組織，已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、

14、農(nóng)藥、化妝品等毒理安全性評價(jià)的必做實(shí)驗(yàn)[5~8]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和滲透到微核研究中，大大拓展了微核試驗(yàn)的檢測和應(yīng)用范圍，已發(fā)展成為能同時(shí)檢測染色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不平衡、基因擴(kuò)增、不分離、DNA 損傷修復(fù)障礙、Hprt基因突變、凋亡、細(xì)胞分裂不平衡等多種遺傳學(xué)終點(diǎn)的檢測，因而近年來國際上有人提出了新微核試驗(yàn)概念[9]，從而大大拓展了微核試驗(yàn)的應(yīng)用范圍[10,11]。當(dāng)然，要實(shí)現(xiàn)一個(gè)實(shí)驗(yàn)多個(gè)遺傳損害終點(diǎn)的檢

15、測，需要更多的新的技術(shù)手段配合，如FISH技術(shù)、圖象分析技術(shù)等等，這也對我國的實(shí)驗(yàn)室條件和研究水平提出了更高的要求。</p><p>　　由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核類的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。目前國內(nèi)外不少部門已把微核測試用于輻射損

16、傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。微核試驗(yàn)已成為檢測藥物、放射線、有毒物質(zhì)的遺傳毒性，反映其對人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的一個(gè)重要方法。近幾年，隨著DNA碎片的分析、細(xì)胞凋亡的研究、單克隆抗體的應(yīng)用、人類基因組學(xué)研究和腫瘤基因組解剖計(jì)劃進(jìn)一步豐富了微核理論。</p><p>　　1.2.2 微核形成的機(jī)理</p><p>　　微核形成的機(jī)理微核

17、形成的機(jī)理，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為微核主要來源于染色體畸變中的無著絲粒斷片和單條或多條染色體。曹佳等采用電鏡、BrdU標(biāo)記、DNA探針雜交等技術(shù)[12~14]，對微核結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)部分淋巴細(xì)胞微核具有一定的結(jié)構(gòu)和功能，部分微核具有DNA復(fù)制能力，不同誘變劑誘導(dǎo)的微核具有不同的染色體組成，并有一定的規(guī)律性。如非整倍體斷裂劑(化學(xué)誘變劑)誘導(dǎo)的微核，主要由丟失的整條染色體組成；染色體斷裂劑(物理因素)誘導(dǎo)的微核，主要由染色體斷片組

18、成。</p><p>　　①化學(xué)誘變學(xué)說：當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)誘變劑作用后，造成染色體斷裂或有絲分裂器(主要指紡錘絲)的損傷，在細(xì)胞分裂后期，此斷片和染色體不能被納入子細(xì)胞核，形成游離在胞質(zhì)中的小核(微核)。紡錘絲毒性類藥物如秋水仙堿、HO一221等直接抑制動物細(xì)胞紡錘絲的形成，阻止細(xì)胞分裂中期紡錘絲將染色體拉至細(xì)胞的兩端。Ando等n應(yīng)用抗腫瘤藥(HO一221)抑制紡錘絲微管組裝，破壞紡錘絲，結(jié)果在染色體分析時(shí)誘導(dǎo)出

19、多倍體和亞二倍體細(xì)胞，未見染色體斷裂，鼠體內(nèi)細(xì)胞也常被誘導(dǎo)出較大的微核。有機(jī)苯能引起微核增多且有明顯的致癌作用，苯三酚(1，2，4一苯三酚，BT)在氧化成醌時(shí)產(chǎn)生活性氧損傷DNA 和其它一些細(xì)胞大分子，實(shí)驗(yàn)中BT能使淋巴細(xì)胞微核率上升2倍，使HK一60細(xì)胞微核率上升8倍，且總微核數(shù)兩類細(xì)胞呈劑量相關(guān)性增高，BT不僅引起染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，而且通過產(chǎn)生新氧間接引發(fā)點(diǎn)突變。此外，我們用不同濃度的重金屬砷、鉛、錳、汞溶液對人外周血淋巴細(xì)胞

20、染毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)微核在一定濃度范圍內(nèi)呈顯著升高趨勢；通過對電焊工、油漆工、汽車司機(jī)、煉油廠職工這些有害因素接觸人群微核的檢測，我們也發(fā)現(xiàn)其微核率明顯高于健康對照組；我們通過</p><p>　　②細(xì)胞組成成分缺乏學(xué)說：有作者對9位健康志愿者進(jìn)行了葉酸限量試驗(yàn)，從基礎(chǔ)用量的195 mg／d，減少到56 mg／d，維持5 w，然后慢慢補(bǔ)充葉酸，減量后的雙核淋巴細(xì)胞和全系淋巴細(xì)胞內(nèi)的微核頻率均增高，且著絲點(diǎn)陽性和陰性的微

21、核都增加。當(dāng)葉酸補(bǔ)充后，兩類細(xì)胞微核率明顯下降，著絲點(diǎn)陽性微核變化更為顯著。實(shí)驗(yàn)表明，低葉酸血癥在臨床貧血癥狀之前，就出現(xiàn)了血液和口腔黏膜細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷口引?？梢娖涠咧g呈負(fù)相關(guān)，而血漿半胱氨酸濃度與微核率呈正相關(guān)，低維生素D導(dǎo)致血液細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷[15]，微核率升高。由此可見，DNA合成過程所需原料的缺乏(關(guān)鍵酶、核苷酸以及膜完整性所需成分等)均可導(dǎo)致微核升高。</p><p>　?、廴旧w畸變斷片學(xué)說：

22、主要指電離輻射(包括X，中子，a)，體內(nèi)外細(xì)胞受照射后，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷，可誘發(fā)微核形成，由此可見這也是微核形成的一個(gè)重要因素[16，17]。研究資料表明，電離輻射誘發(fā)的微核主要是斷片形成的，其原因是電離粒子穿透染色體或其附近時(shí)，是染色體分子電離發(fā)生化學(xué)變化而斷裂形成斷片，最終形成微核，主要是有氧增強(qiáng)自由基增多所致。微核又是細(xì)胞凋亡產(chǎn)物，當(dāng)程序性死亡基因被激活，隨之Ca 依賴性內(nèi)切酶激活切割DNA，形成細(xì)胞核碎片，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核深染，染

23、色質(zhì)邊緣分布的帽形核，最后導(dǎo)致無數(shù)微核。經(jīng)過我們多年對放射工作者、核生產(chǎn)廠礦及核爆試驗(yàn)人員外周血淋巴細(xì)胞微核觀察，發(fā)現(xiàn)放射工作人員淋巴細(xì)胞微核細(xì)胞率、微核陽性檢出率均顯著高于正常健康對照組，受意外照射人員微核明顯增高，淋巴細(xì)胞微核細(xì)胞率、微核陽性檢出率與放射工齡呈陸線正相關(guān)關(guān)系，與個(gè)人年受照射劑量呈直線正相關(guān)，與個(gè)人累積受照劑量直線正相關(guān)。</p><p>　?、苣p傷學(xué)說：有的學(xué)者認(rèn)為，輻射作用于核膜的某一部位

24、，使之變薄、穿孔，由于張力的作用，使核內(nèi)容物從受損膜部位向外突出、延伸、收縊，最終連絲斷裂而形成微核。國際上普遍認(rèn)為微核來源于染色體斷片或丟失的整條染色體，根據(jù)這一理論，細(xì)胞必須經(jīng)過分裂后，才能觀察到微核。但國內(nèi)薛開先采用放射自顯影、間期細(xì)胞及各周期微核定量分析等手段，于1986年首先提出了間期細(xì)胞可以以核芽突方式形成微核學(xué)說。曹佳使用BrdU標(biāo)記和電鏡技術(shù)，也證實(shí)了這一途徑可以解釋部分微核的形成[13,18,19]。兩學(xué)者的工作同時(shí)認(rèn)

25、為：這一途徑與染色體斷片和染色體丟失形成微核理論并不矛盾，都是遺傳物質(zhì)的丟失，具有相同的遺傳毒理效應(yīng)。根據(jù)這一新的論點(diǎn)，在人群監(jiān)測中采集的外周血不需培養(yǎng)，即可直接在外周血淋巴細(xì)胞中觀察到微核的存在。</p><p>　?、莼蛲蛔儗W(xué)說：這里主要指病毒感染，可引起基因突變，蛋白質(zhì)和酶的變化，從而影響DNA的復(fù)制，誘發(fā)染色體畸變形成微核。DNA損傷和修復(fù)在機(jī)體維持動態(tài)的平衡，通過研究自發(fā)微核率與性別、年齡的關(guān)系，我們

26、發(fā)現(xiàn)人體微核呈偏態(tài)分布，說明細(xì)胞存在自發(fā)突變，微核隨年齡增加，不受性別影響，此外，逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和核酶的研究，加深了我們對中心法則的認(rèn)識，拓寬了RNA病毒致癌、致病的研究。病毒癌基因、細(xì)胞癌基因和癌基因活化機(jī)制，以及細(xì)胞凋亡機(jī)制的深入研究，也是對此學(xué)說的有力證明。無論何種學(xué)說，都認(rèn)為微核是核物質(zhì)，并有DNA合成能力。</p><p>　　當(dāng)細(xì)胞微核作為一種評價(jià)指標(biāo)用于輻射損傷、藥物篩選、腫瘤防治的實(shí)驗(yàn)研究, 使

27、它形成“微核測定法”被肯定以來, 人們就越來越關(guān)心和重視細(xì)胞微核在各種因素作用下形成機(jī)理的探討。</p><p><b>　　目的和意義</b></p><p>　　微核實(shí)驗(yàn)從建立開始就因?yàn)槠潇`敏、穩(wěn)定，且能檢測染色體完整性改變和染色體分離改變兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已成為可檢測多終點(diǎn)的分子毒理學(xué)方法。在非整倍體毒劑檢測、致突變物篩選和

28、外來化合物生物毒作用機(jī)制研究等領(lǐng)域有廣閼的應(yīng)用前景。誠然，目前微核實(shí)驗(yàn)還存在：用于檢測微核著絲粒和端粒的DNA探針的特異性和靈敏性不十分滿意、尚不能全面分析微核來源于哪條染色體、微核自動化分析費(fèi)用高等局限性；然而，隨新DNA探針的不斷發(fā)現(xiàn)、多色熒光原位雜交和計(jì)算機(jī)輔助的激光共焦顯微分析技術(shù)的發(fā)展，通過微核實(shí)驗(yàn)?zāi)芨?xì)致、快捷地檢測微核的染色體來源。評價(jià)外來化臺物的毒性作用。</p><p>　　微核試驗(yàn)已成為檢測藥

29、物、放射線、有毒物質(zhì)的遺傳毒性，反映其對人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的一個(gè)重要方法。近幾年，隨著DNA碎片的分析、細(xì)胞凋亡的研究、單克隆抗體的應(yīng)用、人類基因組學(xué)研究和腫瘤基因組解剖計(jì)劃進(jìn)一步豐富了微核理論，但研究范圍仍局限于幼紅細(xì)胞、成熟淋巴細(xì)胞及體外細(xì)胞株。隨著微核試驗(yàn)檢測范圍的進(jìn)一步拓寬，新微核試驗(yàn)正向我們走來，我國學(xué)者應(yīng)加強(qiáng)對這一方法的研究，加大新技術(shù)示范與推廣的力度，以縮小與國際同行研究的距離。</p><

30、;p>　　1.4 課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)思想</p><p>　　本試驗(yàn)的目的是為了掌握微核試驗(yàn)的基本原理和基本技能，通過研究環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)人的外周血淋巴微核形成，判斷微核在細(xì)胞周期的哪個(gè)時(shí)期形成或哪個(gè)時(shí)期微核率（MNF）最大。</p><p><b>　　2 方案論證</b></p><p>　　2.1 方案的設(shè)計(jì)原理</p>

31、<p>　　本試驗(yàn)選取人的外周血淋巴細(xì)胞作為試驗(yàn)對象，觀察環(huán)磷酰胺對其影響以及微核的產(chǎn)生，判斷微核在細(xì)胞周期的哪個(gè)時(shí)期形成或哪個(gè)時(shí)期微核率（MNF）最大，以及微核的一些性質(zhì)研究。</p><p><b>　　2.2 方案論證</b></p><p>　　2.2.1 實(shí)驗(yàn)對象的選擇</p><p>　　微核實(shí)驗(yàn)的研究對象已從骨髓紅細(xì)胞擴(kuò)

32、展到多種在體細(xì)胞和離體培養(yǎng)細(xì)胞。過去認(rèn)為紅細(xì)胞成熟過程中能把主核排出胞外．微核滯留在胞內(nèi)，易于識別，而外周血中的含微核紅細(xì)胞又常被脾臟清除，所以常規(guī)微核實(shí)驗(yàn)以小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞為研究對象。80年代后發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟不能有效清除含微核紅細(xì)胞．小鼠外周血紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果與骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)有較好的一致性。顯然前者更簡便。并可對同一動物進(jìn)行多次采樣分析。目前，該方法已被國際組織普遍接受，日本學(xué)者還直接分離小鼠血中微核進(jìn)行有關(guān)微核染色體組

33、成的研究[23]。最近還發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞也可把微核排出胞外。并且被排出的微核主要來源于整條染色體[24]。</p><p>　　隨技術(shù)發(fā)展，已能有效識別有核細(xì)胞中的微核。人外周血淋巴細(xì)胞、實(shí)體組織活檢細(xì)胞、組織脫落細(xì)胞(口腔、泌尿道)微核率等能在一定程度上反映射線及外來化合物等對某些器官造成的遺傳毒性損害，對腫瘤的研究、診斷均有較大參考價(jià)值，許多研究把它們作為生物劑量監(jiān)測指標(biāo)。生殖細(xì)胞(主要是精子)微核率，由于其特殊的

34、遺傳地位，亦有較多研究報(bào)道。</p><p>　　培養(yǎng)細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)避免了個(gè)體差異因素的影響，易于控制實(shí)驗(yàn)條件，操作簡便。體外培養(yǎng)的血淋巴細(xì)胞、各種哺乳動物細(xì)胞系、原代腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞及蠶豆根尖、紫露草等植物細(xì)胞等已廣泛用于微核實(shí)驗(yàn)研究?？傊筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的細(xì)胞進(jìn)行微核實(shí)驗(yàn)研究。</p><p>　　2.2.2 實(shí)驗(yàn)研究的方法</p><p>　?、偌?xì)胞動力

35、學(xué)阻滯微核分析:1985年Feneeh等建立了該方法，用胞質(zhì)分裂阻滯劑阻斷胞質(zhì)分裂，但不影響胞核分裂，有絲分裂細(xì)胞呈特殊形態(tài)的雙核細(xì)胞，未發(fā)生核分裂的細(xì)胞則維持單核細(xì)胞形態(tài)。檢測致突變固索作用后的雙核細(xì)胞率和雙核細(xì)胞做核率，可同時(shí)獲得致突變因素對細(xì)胞的遺傳毒性損害和對細(xì)胞周期影響的信息。這一方法倍受青睞．迅速得到廣泛應(yīng)用，不僅與后面提及的免疫熒光和原位雜交技術(shù)配合運(yùn)用，可以準(zhǔn)確分辨微核來源，判斷姐妹染色單體在子代細(xì)胞的分市。而且，通過觀

36、察雙核細(xì)胞的兩個(gè)子代核間是否有染色質(zhì)橋，可檢測染色體分離障礙；用阿糖胞苷抑制DNA切除修復(fù)，觀察雙核細(xì)胞微核率的變化，可檢測DNA雙鏈損傷情況及DNA切除修復(fù)缺陷；觀察含6一琉基嘌呤的培養(yǎng)基中生長的雙核和多核細(xì)胞率．可以檢測HPRT基因突變情況[25]。</p><p>　?、诿庖邿晒馕⒑朔治?硬皮病患者血清中含有抗著絲粒(antikinetochore antibodies)，能特異性地與人和一些哺乳動物的著絲

37、粒蛋白結(jié)合，通過免疫熒光技術(shù)檢測微核中是否存在著絲粒蛋白，可初步判斷微核來自于整條染色體還是染色體斷片。由于硬皮病患者常有明顯的CREST征(即鈣質(zhì)沉著、雷諾現(xiàn)象、食管能動性障礙和指、趾硬皮病等)，這種方法也稱CREST染色。1986年Vig[26] 等首先報(bào)道了這一方法，其后很多研究采用了這種方法，我們也用這種方法分析了昆明山海棠和丙烯酰胺誘導(dǎo)的微核[27,28]。由于這種方法檢測的是著絲粒蛋白，如果化合物能使著絲粒蛋白失活或合成受抑

38、，就會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。已有研究表明．絲裂霉素c(mitomyein c)、5一氮胞嘧啶(5一azacyti—dine)、地西泮(diazepam)、甲胺嘧啶(pyrimethamine)和氫釀(hydroq~none)等均可通過上述途徑導(dǎo)致著絲粒陽性微核率下降。然而，這種方法簡便易行，當(dāng)受試化合物對著絲粒蛋白無影響時(shí)，還是相當(dāng)準(zhǔn)確可靠，所以受到不少學(xué)者推崇。</p><p>　　③熒光原位雜交微核分析:用著絲粒D

39、NA探針或同時(shí)應(yīng)用著絲粒和端粒DNA探針，通過熒光原位雜交，檢測做核著絲粒和端粒信號，可準(zhǔn)確判斷微核來源于整條染色體還是染色體斷片，推測微核所含染色體和斷片的數(shù)目。應(yīng)用染色體特異性DNA探針，可檢測姐妹染色單體在于代細(xì)胞的分布(包括染色體丟失和染色體不分離)，分辨微核內(nèi)是否含有某幾條染色體。從而深入分析誘導(dǎo)微核形成的理化因素的遺傳毒性及毒作用靶位等。</p><p>　?、茉粏覦NA合成微核分析:用寡核苷酸引

40、物，通過少數(shù)幾輪PCR原位擴(kuò)增目的DNA序列。并摻入地高辛標(biāo)記的dUTP，如熒光原位雜交一樣地度微核內(nèi)的著絲?；蚨肆３尸F(xiàn)熒光信號。Russo等用這種方法檢測了絲裂霉素C和秋水仙素誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞著絲粒和端粒組成，認(rèn)為這種方法靈敏度高，重復(fù)性好．并且更快捷。</p><p>　?、輰ξ⒑思?xì)胞進(jìn)行凋亡檢測:凋亡是一種由遺傳調(diào)控的細(xì)胞生理性死亡機(jī)制，由于一些癌基因和抑癌基因參與了凋亡的調(diào)控，引起了人們的廣泛關(guān)注。尤其是

41、P53基因，它既參與了DNA損傷所致的細(xì)胞周期阻滯和凋亡，也是維持基</p><p>　　因組穩(wěn)定性所必需。有研究認(rèn)為P53還與微核形成有關(guān)。細(xì)胞遺傳物質(zhì)受損傷可能出現(xiàn)：仍能正常分裂、微核和非整倍體形成、發(fā)生凋亡?？梢?，凋亡也是遺傳毒性損傷后續(xù)效應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，評估化合物遺傳作用時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測有重要意義。</p><p><b>　　3 材料與方法</b>&

42、lt;/p><p><b>　　3.1 材料與儀器</b></p><p>　　3.1.1 藥物與試劑</p><p>　　環(huán)磷酰胺粉末（針劑），生理鹽水，0.5％KCl溶液，蒸餾水，甲醇，冰醋酸，Giemsa原液，1mg/ml Brdu，PHA粉末（針劑），1 ug/ml秋水仙素，滅活小牛血清。</p><p>　　3.1

43、.2 儀器與設(shè)備</p><p>　　試劑瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，注射器，滴管，10ml離心管，鑷子，酒精燈，手套，口罩，離心機(jī)，電子天枰，光學(xué)顯微鏡，37℃培養(yǎng)箱，超凈臺，酒精燈，移液搶，冰箱, 試管架 ，定時(shí)鐘，脫脂玻片，火柴等</p><p><b>　　3.2 實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　3.2.1 溶液的配置</p&g

44、t;<p><b>　　一．常規(guī)溶液</b></p><p>　　(一)1/15mol/L PBS(磷酸緩沖液Phosphate Buffer Solution，PBS)</p><p>　　甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液</p><p>　　Na2HPO4 9.465g<

45、/p><p>　　蒸餾水 加至1000ml</p><p>　　乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液</p><p>　　KH2P04 9.07g</p><p>　　蒸餾水 加至1000m1</p><p

46、>　　分裝在棕色瓶內(nèi)，于4℃冰箱中保存，用時(shí)甲、乙兩液各按不同比例混合，即可得所需pH的緩沖液,見下表:</p><p>　　(二)10μg／ml秋水仙素</p><p>　　秋水仙素 lOmg</p><p>　　生理鹽水 100ml</p><p>　　裝入

47、茶色瓶中，為貯備液，4℃冰箱中保存。甩時(shí)取貯備液1ml加生理鹽水9ml即可。</p><p>　　(三)Giemsa染液</p><p><b>　　1．貯備液</b></p><p>　　Giemsa粉 1g</p><p>　　純甘油

48、66ml</p><p>　　甲醇 66ml</p><p>　　先將Giemsa粉置于研缽中加少量甘油，充分研磨，呈無顆粒的糊狀。再將全部甘油加入，放入56℃溫箱中2小時(shí)，然后加入甲醇，保存于茶色瓶中。一般兩周后使用為好。</p><p><b>　　2．工作液</b></p>&

49、lt;p>　　臨用時(shí)將貯備液與pH6.8的磷酸鹽緩沖液按照1:20混合。</p><p><b>　　二、細(xì)胞培養(yǎng)液</b></p><p>　　(一)0.01mol／LPBS(磷酸鹽緩沖液Phosphate Buffer Saline，PBS)pH7.2。</p><p>　　0.2mol／L磷酸氫二鈉液(甲液)： </p>

50、;<p>　　NaH2PO4·12H2O 35.814g</p><p>　　雙蒸水 加至500ml</p><p>　　0.2mol／L磷酸二氫鈉液(乙液):</p><p>　　NaH2PO4·12H2O

51、 15.601g</p><p>　　雙蒸水 加至500ml</p><p>　　取甲液36ml，乙液14ml和NaCl8.2克，加雙蒸水至1000ml。混勻待完全溶解分裝，經(jīng)高壓滅菌后保存于4℃冰箱備用。</p><p><b>　　(二)Hanks液</b><

52、;/p><p><b>　　1．原液甲</b></p><p>　　NaCl 160g</p><p>　　KCl 8g</p><p>　　MgSO4·7H2O

53、 2g</p><p>　　MgCI2·6H2O 2g</p><p>　　溶于800ml餾水中。</p><p>　　CaCl2(無水) 2.8g</p><p>　　溶于100ml蒸餾水中。<

54、/p><p>　　將兩種液體混合后，加水至1000ml用濾紙濾過，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱備用。</p><p><b>　　原液乙</b></p><p>　　Na2HPO4·12H2O 3.04g</p><p>　　KH2PO4

55、 1.2g</p><p>　　葡萄糖 20.0g</p><p>　　溶于800ml蒸餾水中，用濾紙過濾，然后加0.5％酚紅80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱備用。</p><p>　　(三)1640培養(yǎng)液(含lO％小牛血清)</

56、p><p>　　RPMI-1640粉 10.39g</p><p>　　雙蒸水 加至1000ml</p><p>　　通入適量的C02氣體，邊通入CO2邊慢慢攪拌，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克調(diào)pH值到7.2。</p>&l

57、t;p>　　雙抗100u/ml 10ml</p><p>　　滅活小牛血清 110ml</p><p>　　混勻上述液體，立即用G6抽濾除菌分裝，置4℃冰箱備用。</p><p>　　(四)BrdU溶液(200ug/m1)</p><p

58、>　　用無菌青霉素瓶，在室溫下稱取1.0mg，在無菌條件下加入滅菌生理鹽水9.0ml，溶解，混勻，用黑紙包嚴(yán)，避光置冰箱冰格中保存。最好用時(shí)現(xiàn)配。</p><p><b>　　（五）環(huán)磷酰胺溶液</b></p><p>　　從冰箱中取一只注射用環(huán)磷酰胺粉末（劑量為0.02g），用20ml的超凈水溶解，使得環(huán)磷酰胺濃度為10mg/ml。由于使用時(shí)的濃度為1mg/m

59、l，因此使用時(shí)稀釋10倍即為成為配制成1mg/ml環(huán)磷酰胺溶液。</p><p><b>　　（六）制片固定液</b></p><p>　　甲醇：冰醋酸(3：1)混合液，現(xiàn)配先用。</p><p>　　（七）外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液的配置</p><p>　　將兩瓶肝素40ml,每瓶加10ml小牛血清，配置成20%的小牛血瓶

60、培養(yǎng)液，封口，放入4℃冰箱儲存</p><p>　　3.2.2 取血及外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) </p><p>　　抽取健康男性的靜脈血各5ml,分別加入到3個(gè)培養(yǎng)瓶（裝有50 ml 20%的小牛血瓶培養(yǎng)液），血液加入培養(yǎng)液后搖勻（不能太劇烈）分裝。因此每個(gè)時(shí)期有三組。</p><p>　　1、G0期：分裝8ml加血液的培養(yǎng)液，不加PHA，接種后立刻加入1mg/ml環(huán)

61、磷酰胺0.2ml，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h收獲。</p><p>　　2、在剩下的血液培養(yǎng)液中加入一支PHA（先用2ml超凈水溶解）。</p><p>　?、?、G1期：分裝10ml加血液的培養(yǎng)液，立刻加入1mg/ml環(huán)磷酰胺 0.2ml在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h收獲。</p><p>　?、?、S.G2期：分裝20ml加血液的培養(yǎng)液接種后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4

62、8h收獲。其中培養(yǎng)20h-24h后，加入1mg/ml環(huán)磷酰胺 0.4ml;收獲前 2.5-3h，加入1 ug/ml秋水仙素1.05ml;收獲前30min，加入1mg/ml Brdu 0.33ml。</p><p>　　③、M期：分裝10ml加血液的培養(yǎng)液接種后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46h，加入1mg/ml環(huán)磷酰胺0.2ml，收獲前 2.5-3h，加入1 ug/ml秋水仙素0.53ml ,收獲前30min加入1mg/

63、ml Brdu 0.17ml。</p><p>　　3.2.3 外周血淋巴細(xì)胞微核制片</p><p>　　1、收集培養(yǎng)物：培養(yǎng)時(shí)間滿時(shí)取出培養(yǎng)瓶，輕輕去掉瓶蓋，用帶帽滴管吸去每瓶上清液(1.0ml)，然后兩瓶平行標(biāo)本合并移入l0ml離心管內(nèi)。如培養(yǎng)物取出時(shí)已混，則兩瓶混勻后移入l0ml離心管中，與對照平衡后1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸去上清留底液。</p><p>

64、;　　2、低滲：往已有2ml培養(yǎng)物離心管內(nèi)加入0.5％KCl溶液8ml，混合后放37oC保溫低滲10分鐘。</p><p>　　3、預(yù)固定：低滲后加固定液0.5ml，混勻后1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用滴管去掉上清(要盡量把上清去凈，但不能丟失沉淀物)。</p><p>　　4、固定：將沉淀物輕輕混勻后，沿離心管壁加入固定液并迅速輕輕與沉淀物混合，有塊狀物要打散，然后加固定液至3～4ml，蓋

65、上蓋，放37℃保溫固定15分鐘。固定后以1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取出后去上消(要盡量把上清去凈，但不能丟失沉淀物)，如此反復(fù)再固定2次。</p><p>　　5、制片：第三次固定后去上清，留沉淀物0.2～0.4ml，混勻后用滴管吸取分別滴在己預(yù)冷的玻片左右各三分之一處，輕輕吹散，然后通過火焰固定，即為未染色標(biāo)本，備用。</p><p><b>　　3.2.4 染色 </b

66、></p><p>　　本試驗(yàn)采取Giemsa染色，待骨髓片自然晾干之后，用新鮮配制的PH7.4的磷酸鹽緩沖液的10%的Giemsa染液染色10~15min，染色完畢后用蒸餾水沖洗，自然晾干即可。</p><p>　　3.2.5 觀察結(jié)果</p><p>　　先以低倍鏡，選擇細(xì)胞分布均勻、疏密適度、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域，然后再在高倍鏡下對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照

67、。</p><p><b>　　4 結(jié)果與討論</b></p><p><b>　　4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　4.1.1環(huán)磷酰胺（誘導(dǎo)微核照片：</p><p>　　圖4-6 Go期 hp（1） 100ⅹ10 圖4-7 Go期 hp（2）

68、 100ⅹ10</p><p>　　圖4-1 G1期 hp（1） 100ⅹ10 圖4-2 G1 期hp（2） 100ⅹ10</p><p>　　圖4-3 微核增值期 hp（1） 100ⅹ10 圖4-4 S期 hp（2） 100ⅹ10</p><p>　　圖4-5 G2期 hp

69、 100ⅹ10</p><p>　　圖4-8 M期hp（1） 100ⅹ10 圖4-9 M期 hp（2） 100ⅹ10</p><p><b>　　4.1.2微核計(jì)數(shù)</b></p><p>　　4.1.3淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期各時(shí)期的微核率</p><p><b>　　

70、4.2結(jié)果與分析</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: </b></p><p>　?、偌?xì)胞周期各階段均可有不同程度的微核形成, 其中最多的是G1期, 其次是G2期，其他各時(shí)期均可能形成較少量的微核。</p><p>　?、赟期細(xì)胞的微核率較G1期有極顯著的下降,這提示大部分G1期的微核細(xì)胞不能進(jìn)人S期, 使細(xì)胞增殖中

71、止, 這可能是抗癌藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一。</p><p>　?、蹐D4-8M期微核照片一定程度上證明了微核起源于落后染色體與喪失著絲粒的斷片。</p><p><b>　　結(jié)論與心得</b></p><p><b>　　5.1結(jié)論</b></p><p>　　細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期均可形成微核, 其

72、中微核最多的時(shí)期是G1期, 其次是G2期。 S期細(xì)胞的微核率較G1期有極顯著的下降,這表明大部分G1期的微核細(xì)胞不能進(jìn)人S期, 使細(xì)胞增殖中止，這為預(yù)防治療癌癥腫瘤有很深遠(yuǎn)的意義。</p><p><b>　　5.2心得</b></p><p>　　5.2.1 歸納總結(jié)</p><p>　　在制片的過程中，要將玻片事先放入冰箱，準(zhǔn)備好冰片。制

73、片以滴片的方式進(jìn)行，使用冰片是因?yàn)楸男Ч糜谄胀úＦ?lt;/p><p>　　5.2.1.2 染色</p><p>　　本試驗(yàn)采取Giemsa染色，在染色時(shí)應(yīng)注意將染色液覆蓋滿整個(gè)玻片，使得染色過程進(jìn)行得更為充分。同時(shí)也要在玻片下面墊上紙片，以免Giemsa染液對實(shí)驗(yàn)臺造成污染。染色時(shí)間應(yīng)該不低于15分鐘，用蒸餾水沖洗染液時(shí)，應(yīng)該讓蒸餾水以細(xì)小的水流均勻的從玻片一端沖下，并且不能讓水

74、流直接接觸被染色的細(xì)胞，以免將細(xì)胞沖走。</p><p>　　5.2.2 尚存在的問題</p><p>　　經(jīng)過了資料查找與總結(jié)，方案的提出與修改，以及實(shí)驗(yàn)這幾個(gè)階段，最終得出了一些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，但是在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)了許多的問題和大量有待于改進(jìn)的地方。</p><p>　　5.2.2.1 染色方法的使用</p><p>　　進(jìn)行微核試驗(yàn)時(shí)，

75、一般會選擇Giemsa染色，feulgen染色以及吖啶橙熒光染色這三種染色方法。本試驗(yàn)中采取的是簡單，易操作的Giemsa染色，雖然這種方法尤其突出的優(yōu)勢，但是也存在一些不足。一般來說，這種染色不能分辨細(xì)胞中的DNA、RNA以及其他的嗜堿性顆粒，因此容易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象，高估嗜多染紅細(xì)胞中微核產(chǎn)生的水平。由于試驗(yàn)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室條件等因素的限制，本試驗(yàn)只采取了一種染色方法。希望在以后的試驗(yàn)中，能夠采取幾種不同染色的方法同時(shí)進(jìn)行觀察。例如可以將

76、Giemsa染色和吖啶橙熒光染色分別運(yùn)用到同一試驗(yàn)中，以便更準(zhǔn)確的觀察試驗(yàn)結(jié)果。</p><p>　　5.2.2.3 探究微核試驗(yàn)中染色體損傷的機(jī)制</p><p>　　本試驗(yàn)屬于傳統(tǒng)的微核試驗(yàn)，只能觀察化學(xué)毒性物質(zhì)對于淋巴細(xì)胞的遺傳毒性作用，無法鑒別毒性藥物是屬于非整倍體劑還是染色體斷裂劑。如果將免疫熒光技術(shù)引入這項(xiàng)傳統(tǒng)的微核試驗(yàn)之中，突顯出染色體的著絲粒部分，則可以通過鑒別細(xì)胞中的微

77、核是由染色體斷片還是含著絲粒的染色體片段或一條甚至多條染色體組成，來鑒別化學(xué)毒性物質(zhì)的種類。</p><p>　　希望在今后的試驗(yàn)中引入熒光免疫技術(shù)，確定遺傳毒性物質(zhì)的種類以及染色體受損傷的最主要的原因和機(jī)制。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 曹佳，林真，余爭平．微核試驗(yàn)一原理、方法及其在人群監(jiān)測和毒性

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