液相色譜分析分離甲地孕酮中2α-甲基化雜質(zhì)【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　液相色譜分析分離甲地孕酮中2α-甲基化雜質(zhì)</p><p><b>　　專業(yè)：應(yīng)用化學(xué)</b></p><p>　　摘要：隨著醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，新藥的開發(fā)也

2、不斷增長(zhǎng)。而制備新藥的過程中，總伴隨著副產(chǎn)物的產(chǎn)生。本文利用高效液相色譜儀對(duì)某一新藥甲地孕酮中的2α-甲基化雜質(zhì)成分進(jìn)行分離、提純。確定液相色譜分離、提純時(shí)最優(yōu)的波長(zhǎng)，流速，流動(dòng)相的比例等一系列色譜條件，通過富集，層析，液相色譜分離等操作，最終使目標(biāo)雜質(zhì)純度超過85%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：高效液相色譜儀；2α-甲基化雜質(zhì)；分離</p><p>　　The separation o

3、f 2α-methylated impurities from </p><p>　　megestrol acetate by HPLC</p><p>　　Abstract：With the development of the medicine field, development of new drugs is also growing. In the process of drug

4、 preparation, it is always accompanied by-products. In this paper, by using high performance liquid chromatography, a new drug of 2α-methylated impurities in megestrol acetate was separated and purified. The optimal wave

5、length, flow rate, the ratio of mobile phase of chromatographic conditions of liquid chromatography was determined. Through enrichment, chromatography and other ex</p><p>　　Key words： HPLC; 2α-methylated imp

6、urities;separation</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1. 引言1</b></p><p>　　1.1 研究背景1</p><p>　　1.2 高效液相色譜國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀1</p><p>　　1.3色譜技術(shù)的發(fā)展歷

7、程2</p><p>　　2. 高效液相色譜2</p><p>　　2.1高效液相色譜的原理2</p><p>　　2.2高效液相色譜的特性2</p><p>　　2.3高效液相色譜的應(yīng)用3</p><p>　　2.3.1生物堿類化合物3</p><p>　　2.3.2黃酮類化合物

8、3</p><p>　　2.3.3雷奈酸鍶4</p><p>　　2.4高效液相色譜的構(gòu)成5</p><p>　　2.4.1輸液系統(tǒng)——泵5</p><p>　　2.4.2 進(jìn)樣系統(tǒng)5</p><p>　　2.4.3 分離系統(tǒng)——色譜柱5</p><p>　　2.4.4檢測(cè)系統(tǒng)6&l

9、t;/p><p>　　2.4.5輸出系統(tǒng)6</p><p><b>　　3. 實(shí)驗(yàn)部分6</b></p><p><b>　　3.1 儀器6</b></p><p><b>　　3.2 試劑6</b></p><p>　　3.3 2α-甲基化雜質(zhì)的確

10、定6</p><p>　　3.4 實(shí)驗(yàn)步驟6</p><p>　　3.4.1前處理6</p><p>　　3.4.2 分離最優(yōu)條件的確定7</p><p>　　3.4.3 液相色譜的分析10</p><p>　　3.4.4 組分純度測(cè)定10</p><p><b>　　4.

11、 結(jié)論10</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)11</b></p><p><b>　　致謝11</b></p><p><b>　　附錄12</b></p><p><b>　　引言</b></p><p

12、><b>　　1.1 研究背景</b></p><p>　　甲地孕酮為一高效黃體激素，除與雌激素配伍用作口服避孕藥外，單獨(dú)使用本品作為速效避孕藥。從胃腸道吸收，主要從尿液排出，也可以從糞便排出，代謝物為葡糖醛酸甙。主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、功能性子宮出血、子宮內(nèi)膜異位癥；晚期乳腺癌和子宮內(nèi)膜腺癌；亦可作為短效復(fù)方口服避孕片的孕激素成分。用合成的甲地孕酮治療乳腺和前列腺癌一個(gè)明顯的副反應(yīng)是增

13、強(qiáng)食欲，體重增加，且不一定伴有液體潴留。雖與激素對(duì)腫瘤的療效是無關(guān)的，但這是一個(gè)有利的副反應(yīng)。</p><p>　　在合成甲地孕酮這一類藥物時(shí)，總伴隨著雜質(zhì)的產(chǎn)生。由于制備藥物的原料、環(huán)境等各種條件的不同，因此最終藥物中含有的雜質(zhì)也有所區(qū)別，需要進(jìn)行檢測(cè)。本文需要檢測(cè)的甲地孕酮藥物中含有的雜質(zhì)，經(jīng)過制藥廠商檢測(cè)后，其結(jié)構(gòu)如圖1-1所示：</p><p>　　圖1-1 2α-甲基化雜質(zhì)<

14、;/p><p>　　該雜質(zhì)通過查詢資料后，其名字為α-甲基化雜質(zhì)。為了檢測(cè)該雜質(zhì)對(duì)人體是否有效，且對(duì)藥性是否有影響，對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分離、提純，且濃度需超過85%才能進(jìn)行檢測(cè)。</p><p>　　1.2 高效液相色譜國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀</p><p>　　隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)于某些活性大分子為主的重要制品和藥劑(如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、干擾素、生長(zhǎng)激素等)，如諾采用傳統(tǒng)的分離技術(shù)如超濾

15、、沉淀、超離心、萃取等往往達(dá)不到所需的純度要求。人們?cè)趯?duì)高效的分離與純化技術(shù)的探索中,將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了色譜法,進(jìn)而促進(jìn)了色譜分離技術(shù)的迅速發(fā)展,使得色譜分離在理論上從線性色譜發(fā)展到非線性色譜, 在實(shí)踐中從分析規(guī)模發(fā)展到制備規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模。</p><p>　　然而，在色譜法中還分為制備色譜和分析色譜。制備液相色譜并不是分析色譜的簡(jiǎn)單放大，相對(duì)于分析色譜而言有很多不同之處[1]。例如，分析色譜主要功能是全面反映樣

16、品組成信息，不需要收集特定的餾分，流動(dòng)相通常廢棄；而制備色譜卻對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的純度、產(chǎn)量、生產(chǎn)周期等卻為主要考慮因素，因此制備型色譜和分析型色譜在參數(shù)的設(shè)置和優(yōu)化上有很大不同。近代色譜中，高效液相色譜(HPLC)的出現(xiàn)和快速發(fā)展，將分析和制備比較良好的結(jié)合，使其應(yīng)用越來越廣泛。</p><p>　　1.3色譜技術(shù)的發(fā)展歷程</p><p>　　色譜技術(shù)的研究起步于20世紀(jì)初，俄國(guó)植物學(xué)家發(fā)表了

17、題為“一種新型吸附現(xiàn)象在生化分析上的應(yīng)用”的研究論文中提到了一種用吸附原理分離植物的方法，并將其命名為色譜法。但由于這種色譜分離技術(shù)速度慢且效率低，沒有受到科學(xué)界重視。</p><p>　　德國(guó)化學(xué)家利用色譜分離技術(shù)，在維生素和胡蘿卜素的分離和結(jié)構(gòu)的分析中取得了重大成果，色譜法因此得到各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注?？梢灶A(yù)想到，在接下來的幾十年中，色譜技術(shù)更是飛速發(fā)展[2]。</p><p>　　隨著世

18、界各國(guó)的研究者先后提出液液分配色譜法，氣相色譜。短期內(nèi)，通過各國(guó)科學(xué)家的努力，又分別開創(chuàng)了毛細(xì)管氣相色譜法、毛細(xì)管超臨界色譜、毛細(xì)管電泳和電色譜等分析分離技術(shù)，使色譜技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛。</p><p>　　高效液相色譜出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代末，由高壓泵和鍵合固定相應(yīng)用于液相色譜，導(dǎo)致了高效液相色譜的出現(xiàn)。直至今日，高效液相色譜技術(shù)不斷發(fā)展，并廣泛應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域，成為分析、分離技術(shù)中不可或缺的一種尖端科技。<

19、;/p><p><b>　　高效液相色譜</b></p><p>　　2.1高效液相色譜的原理</p><p>　　它的原理是在被流動(dòng)相液體帶入色譜柱中時(shí)，利用復(fù)雜混合物在固定相和流動(dòng)相中不同的分配系數(shù)、吸附能力等因素，使各組分彼此分離，從而達(dá)到分離的目的。高效液相色譜按操作方式和目的來分，可分為分析型和制備型兩種。為了了解樣品性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、組成等信

20、息的為分析型；而制備型則是為了獲得目標(biāo)組分[3]。所以，可以說分析型為分析工具，而制備型為分離技術(shù)。由于分析型和制備型需要的操作條件明顯不同，因此前者進(jìn)樣量越小越好，且要避免色譜柱的超載問題；后者則要提高產(chǎn)量，色譜柱的超載是必須的。</p><p>　　2.2高效液相色譜的特性</p><p>　　這種分離技術(shù)具有操作條件溫和、選擇性高、批處理量較大和操作自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，可以將物化差別很小的

21、復(fù)雜化合物分離，使之成為分析分離各種物質(zhì)最有效的方法之一。液相色譜法對(duì)要進(jìn)行分離的樣品要求較低，不受樣品揮發(fā)度和穩(wěn)定性的限制，且非常適合含有離子型化合物、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物等大分子的生物藥品，使之在廣泛的領(lǐng)域發(fā)揮作用。因此，高效液相色譜法仍是從事研究工作和工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用比較普遍的色譜法。</p><p>　　2.3高效液相色譜的應(yīng)用</p><p>　　近年來，從天然產(chǎn)物或者人工合成化合物

22、并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一[4]。新藥開發(fā)是人類健康的重要保障，而在新藥開發(fā)過程中，總伴隨著一些不必要的多余物質(zhì)產(chǎn)生，為了從藥品中分離出更多這些未知物質(zhì)，確定其結(jié)構(gòu)，以滿足新藥順利通過臨床，需要借助于具有更快速、高效的分離能力的技術(shù)，而高效液相色譜以其良好的分離度、靈敏度的特性，穩(wěn)定的運(yùn)行條件，成為了現(xiàn)階段藥物研究中不可或缺的重要手段。</p><p>　　2.3.1生物堿類化合物</p>

23、<p>　　生物堿是天然的含氮化合物，大多數(shù)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。Mueller等[5]采用多種類型的制備色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，從生長(zhǎng)于澳大利亞的植物 Mitrephora diversifolia中分離得到了抗瘧藥芴酮生物堿。艾秀珍等[6]對(duì)辣椒精進(jìn)行預(yù)處理,首先從中制得白色辣椒堿類化合物，然后用適量流動(dòng)相解，采用ODS C18柱(200mm*1010mm,25～40μm)對(duì)其進(jìn)行純化。它的操作工藝為：流

24、動(dòng)相為甲醇-水，比例為75:25，辣椒堿類化合物進(jìn)樣質(zhì)量濃度為180g·L-1，進(jìn)樣體積為2108mL，流速為410mL·min-1。得到的辣椒堿單體檢測(cè)其純度為95.123%，回收率計(jì)算后為93.127%，產(chǎn)率為4138g·L-1·h-1，單位產(chǎn)品流動(dòng)相消耗為0.1087L·g-1。邊清泉[7]在從喜樹堿提取物中制作喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，所用的色譜柱為Shim-pack PREP-ODS(H

25、) KIT(250mm*20mm)，使用的流動(dòng)相為甲醇-水-異丙醇，流速為10mL·min-1，產(chǎn)品檢測(cè)后純度達(dá)99.164%。</p><p>　　2.3.2黃酮類化合物</p><p>　　黃酮類化合物是一類廣泛存在于自然界的重要的天然產(chǎn)物，其化學(xué)成分具有多種藥理活性。以有文獻(xiàn)[8-9]采用HPLC分離黃酮類化合物進(jìn)行了報(bào)道(見表2-1)。</p><p&

26、gt;　　表2-1 黃酮類化合物的分離</p><p><b>　　2.3.3雷奈酸鍶</b></p><p>　　雷奈酸鍶(strontium ranelate)，化學(xué)名為5-[雙(羧甲基)氨基]-2-噻吩甲酸-4-氰基-3-乙酸二鍶鹽，該藥品是法國(guó)施維雅公司最新開發(fā)的新一代抗骨質(zhì)疏松藥，2004年獲歐盟批準(zhǔn)上市，商品名為Protelos[10-11]。本品在制備過

27、程中易產(chǎn)生雜質(zhì)，需定量控制。在于海英等對(duì)其重結(jié)晶母液中回收得到產(chǎn)品的高效液相色譜圖譜中發(fā)現(xiàn)了除了藥物的主要成分的保留時(shí)間為4.28min外，還有另一主要雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間達(dá)到了1.8min。對(duì)該雜質(zhì)的峰面積計(jì)算其含量約為5.3%。其工藝流程為:色譜柱Shimadzu ODS C18柱(4.6mm×250mm,5µm)；使用的流動(dòng)相為乙腈-10mmol乙酸銨溶液(7:93)(加冰乙酸調(diào)至pH 4.0)，分離制備的流速0

28、.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；進(jìn)樣量20μL。最終確定藥物中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，化學(xué)名為：2-[雙(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-噻吩乙酸。</p><p>　　綜上所述，采用高效液相色譜不僅能從藥物中分離提純混合在化合物中的雜質(zhì)單體，而且由生物堿類化合物、黃酮類化合物的應(yīng)用中可以看出，使用高效液相進(jìn)行分離后得到的物質(zhì)濃度較高，可以用來物質(zhì)的后續(xù)研究，來確定未知物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、物化特性、是否具有毒性等各方面進(jìn)行檢測(cè)。從

29、雷奈酸鍶(strontium ranelate)的應(yīng)用中可以看出，高效液相色譜產(chǎn)率搞、速度快、操作簡(jiǎn)便、便于收集，并且可以分析出目標(biāo)物質(zhì)在母液中的大致含量，方便于下一步實(shí)驗(yàn)方案的制定[12]。為將要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)提供了需要的資料，并可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使進(jìn)行實(shí)驗(yàn)更加精確、快速。</p><p>　　2.4高效液相色譜的構(gòu)成</p><p>　　高效液相色譜是近幾十年來分析化學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一[

30、13]。這種將分離手段及檢測(cè)系統(tǒng)相連接的分析分離技術(shù)，逐步成為在生化藥物、精細(xì)化工產(chǎn)品、環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域中主要的物質(zhì)分析分離方法。</p><p>　　2.4.1輸液系統(tǒng)——泵</p><p>　　由于色譜柱很細(xì)，填充劑粒度小，因此阻力很大，為達(dá)到快速、高效的分離效果，必須要提高柱前壓力，以獲得高速的液流，使分析、分離更加有效率的進(jìn)行。泵為液相色譜提供了流動(dòng)相流動(dòng)所必須的壓力。</

31、p><p>　　2.4.2 進(jìn)樣系統(tǒng)</p><p>　　一般高效液相色譜對(duì)于進(jìn)樣系統(tǒng)多采用六通閥進(jìn)樣[14]。</p><p><b>　　圖2-1 </b></p><p><b>　　六通進(jìn)樣閥</b></p><p>　　(a)取樣；(b)進(jìn)樣</p>

32、<p>　　1,4-定量管；2-泵；3-色譜柱；5,6-排液管</p><p>　　先由注射器將樣品常壓下注入樣品環(huán)。然后切換閥門到進(jìn)樣位置，由高壓泵輸送的流動(dòng)相將樣品送人色譜柱。樣品環(huán)的容積是固定的，因此進(jìn)樣重復(fù)性好，且可以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性。 </p><p>　　2.4.3 分離系統(tǒng)——色譜柱</p><p>　　色譜柱是高效液相色譜技術(shù)中最關(guān)鍵的

33、一個(gè)組成部分，起著至關(guān)重要的作用。它作用于樣品中各種不同組分，使這些組分按順序進(jìn)入檢測(cè)器中，從而起到分析分離的作用。色譜柱按操作方式和目的來分，可分為用于分析樣品性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等特性的分析型色譜柱和用于分離、提純樣品，提高樣品質(zhì)量的制備型色譜柱。而按分離模式來分，可以主要分為正相吸附色譜和反相分配色譜。其中，正相吸附色譜一般以己烷、庚烷做為非極性流動(dòng)相，色譜柱中的固定相為極性，從而吸附各種物質(zhì)，使非極性物質(zhì)先進(jìn)入檢測(cè)器出峰；而反相分配色譜一

34、般以甲醇、乙醇、乙腈或二氯乙烷等做為極性流動(dòng)相，色譜柱中的固定相為非極性物質(zhì)，使極性物質(zhì)先出峰。一般日常使用中，使用反相色譜的概率約為八成，本次實(shí)驗(yàn)也使用反相分配色譜柱。</p><p>　　色譜柱另外一個(gè)重要的影響因素為色譜柱中的填充物。在日常使用中，一般以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等集團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上做為固定相，其具有固定相穩(wěn)定，不易流失；應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑；消除硅羥基的不良影響等特點(diǎn)

35、。</p><p>　　2.4.4 檢測(cè)系統(tǒng)</p><p>　　高效液相色譜檢測(cè)器是關(guān)鍵部件之一。它的作用主要是把經(jīng)過色譜柱的流動(dòng)相中的樣品組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，并在計(jì)算機(jī)上輸出，產(chǎn)生譜圖。檢測(cè)器一般要符合靈敏度高、對(duì)外界變化不敏感、線性范圍寬、重復(fù)性好、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)[15]。按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器、熱學(xué)檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等，其中最常用的為紫外-可見光檢測(cè)器，以及針對(duì)在紫外區(qū)有有吸

36、收的化合物所使用的二極管陣列檢測(cè)器。本次實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的物質(zhì)在紫外光中有吸收，因此，使用的為紫外-可見光檢測(cè)器。</p><p>　　2.4.5 輸出系統(tǒng)</p><p>　　將一臺(tái)計(jì)算機(jī)與高效液相色譜儀器相連接，并安裝所需軟件，可對(duì)液相裝置進(jìn)行調(diào)試以及相關(guān)條件的改變。在檢測(cè)系統(tǒng)將樣品組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后，在計(jì)算機(jī)上輸出，并產(chǎn)生譜圖，用來處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和反控儀器運(yùn)行。</p>&

37、lt;p><b>　　實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p><b>　　3.1 儀器</b></p><p>　　島津液相色譜儀SPD-20A（含AB泵LC-20AD,230V），shim-pack-clc-ods色譜柱(日本島津，16.0mm*150mm,粒徑5μm )、SunFire Prep C18半制備柱（10mm*250mm,粒徑5μ

38、m）、紫外檢測(cè)器，液相微量注射器，廢液接收瓶，基本玻璃儀器（圓底燒瓶、試管、燒杯等）。</p><p><b>　　3.2 試劑</b></p><p>　　色譜純甲醇(色譜純，天津四友)；乙腈(分析純)；石油醚(分析純)；乙酸乙酯(分析純)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈有限公司)。</p><p>　　3.3 2α-甲基化雜質(zhì)的確定</p&

39、gt;<p>　　含有2α-甲基化雜質(zhì)的甲地孕酮，通過簡(jiǎn)單處理后，所得到的液體為母液。廠商通過檢測(cè)后得到的高效液相圖譜如附錄圖1，從中可以找到需要分析分離的2α-甲基化雜質(zhì)。然而在不同的高效液相儀器上檢測(cè)，所呈現(xiàn)的譜圖會(huì)有相對(duì)的差異，因此需要對(duì)母液進(jìn)行重新定位。通過實(shí)驗(yàn)，得到的高效液相色譜圖如附錄圖2。與原來的譜圖進(jìn)行比對(duì)，可以尋找出在圖2上的13#峰與原來譜圖上的9#目標(biāo)峰相對(duì)應(yīng)，所以在新譜圖上確定13#為需要進(jìn)行分析、

40、分離的目標(biāo)峰。</p><p><b>　　3.4 實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p><b>　　3.4.1前處理</b></p><p>　　取含有0.2%2α-甲基化雜質(zhì)的粉末狀固體20g，加入200mL甲醇，配成母液備用。將母液裝入圓底燒瓶中，搭建回流裝置并進(jìn)行加熱回流，以促使原料物充分溶解。進(jìn)行重結(jié)晶操作，收集濾液

41、，并將濾液重復(fù)上述過程三次，從而使目標(biāo)分離物在晶體中含量提高到1%左右。</p><p>　　將得到的1%的目標(biāo)雜質(zhì)，加入少量色譜甲醇進(jìn)行溶解，準(zhǔn)備進(jìn)行分析。選用ultra pack ods-sm-50c型號(hào)的硅膠柱(37*300mm)，并按要求在硅膠分析柱填充石油醚和乙酸乙酯(65:35)，裝柱后，以色譜純甲醇和哇哈哈純凈水作為流動(dòng)相，用高壓恒流泵（FL2200,浙江福立分析儀器有限公司）將流動(dòng)相打入分析柱，以

42、保證其流量為10mL/min，對(duì)目標(biāo)分離物進(jìn)行分析。</p><p>　　硅膠柱層析操作：選取ultra pack ods-sm-50c硅膠柱（37*300mm）來進(jìn)行過柱操作，首先按要求在硅膠柱內(nèi)裝入石油醚和乙酸乙酯（65:35），然后把含1%的目標(biāo)分離物加入到硅膠柱內(nèi)，流量控制在10mL/min左右。接著我們需要進(jìn)行點(diǎn)板，以確定我們所要收集的目標(biāo)分離物。從硅膠柱下端出口接取一點(diǎn)目標(biāo)分離物點(diǎn)在薄層板的左側(cè)標(biāo)為a

43、點(diǎn)，再在右側(cè)點(diǎn)一點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)為b點(diǎn)。觀察兩個(gè)點(diǎn)變化趨勢(shì)的如圖3-1，圖3-2，圖3-3所示。當(dāng)a點(diǎn)顏色變化明顯淺于b點(diǎn)說明已經(jīng)開始出現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物，只是含量還很低。此時(shí)開始收集流出液。繼續(xù)重復(fù)點(diǎn)板操作，可以看到a點(diǎn)顏色慢慢變深與b點(diǎn)接近（圖3-2），然后再慢慢變淺（圖3-3），此時(shí)即可停止收集。</p><p>　　圖3-1 初期點(diǎn)板圖 圖3-2 中期點(diǎn)板圖 圖3-3 后

44、期點(diǎn)板圖</p><p>　　將收集到的流出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，對(duì)目標(biāo)分離物進(jìn)行檢測(cè)其純度為29.5%。其高效液相色譜圖為附錄圖3所示。</p><p>　　3.4.2 分離最優(yōu)條件的確定</p><p>　　3.4.2.1波長(zhǎng)的選擇</p><p>　　根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道，大部分的物質(zhì)在波長(zhǎng)190-400nm范圍內(nèi)，而需要檢

45、測(cè)的母液在254nm出有較強(qiáng)的吸收峰，目標(biāo)產(chǎn)物最強(qiáng)吸收峰未知，因此考慮到對(duì)二者同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采用254nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。</p><p>　　3.4.2.2流動(dòng)相的選擇</p><p>　　高效液相色譜通常使用的流動(dòng)相為乙腈/水和甲醇/水體系。將母液用常用的流動(dòng)相乙腈/水和甲醇/水體系進(jìn)行了檢測(cè)，后發(fā)現(xiàn)甲醇/水系統(tǒng)對(duì)物質(zhì)吸收時(shí)峰形較好，且各組分的基線分離情況比使用乙腈/水系統(tǒng)優(yōu)，因此

46、選用流動(dòng)相為甲醇/水。</p><p>　　3.4.2.3流量與進(jìn)樣量的選擇</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用色譜柱的最佳流量為1.0mL/min進(jìn)行最優(yōu)條件的檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)進(jìn)行半制備時(shí)改為3.0mL/min，可以更好的達(dá)到基線分離，得到較滿意結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在選擇最優(yōu)條件時(shí)，當(dāng)進(jìn)樣量為色譜柱最大進(jìn)樣量時(shí)，會(huì)出現(xiàn)“過載”現(xiàn)在。因此，對(duì)進(jìn)樣量為5，10，15進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，觀察對(duì)峰形的影響。

47、最終結(jié)果表明進(jìn)樣量為10μL時(shí)，母液的分離效果及峰形最好。</p><p>　　3.4.2.4流動(dòng)相的比例</p><p>　　高效液相色譜檢測(cè)中，流動(dòng)相的比例可以對(duì)峰形及峰出現(xiàn)的時(shí)間產(chǎn)生較大的影響，本文在其他條件固定的情況下，采用4種不同的流動(dòng)相比例對(duì)母液進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，對(duì)比不同流動(dòng)相比例下的樣品色譜圖，從而得出最優(yōu)比例。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)條件：1.波長(zhǎng)：25

48、4nm.</p><p>　　2.流動(dòng)相：色譜級(jí)甲醇和純凈水.</p><p>　　3.流量：1.0mL/min.</p><p>　　4.進(jìn)樣量：10微升</p><p>　　不同流動(dòng)相比例圖譜如下：</p><p>　　甲醇:水=80%:20%</p><p>　　圖3-4 甲醇:水=80%

49、:20% 色譜圖</p><p>　　如圖3-4所示，當(dāng)甲醇:水比例為80%:20%時(shí)，雖然時(shí)間較短，可以提高效率，但是、目標(biāo)峰沒有被完全分離出來，其中包含大量其他物質(zhì)，要進(jìn)行多次分離才可達(dá)到預(yù)期純度，因此不采用該比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　B.甲醇:水=70%:30%</p><p>　　圖3-5甲醇:水=70%:30% 色譜圖</p>&l

50、t;p>　　如圖3-5所示，當(dāng)甲醇/水比例為70%:30%時(shí)，目標(biāo)峰前的小峰依然有小部分被包含，如果用該流動(dòng)相比例進(jìn)行分離，會(huì)使最終的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量降低，將有較多雜質(zhì)混入，需再次分離來提高其純度。</p><p>　　C.甲醇:水=67%:33%</p><p>　　圖3-6甲醇:水=67%:33% 色譜圖</p><p>　　如圖3-6所示，當(dāng)流動(dòng)相比例為67

51、%:33%時(shí)，目標(biāo)峰完整，且峰形較好，并且為一個(gè)孤立整體，對(duì)收集較為有利。圖3-6與圖3-4相比，由于峰形的獨(dú)立，減少了雜質(zhì)的混入，從而可以得到純度較高的目標(biāo)物質(zhì)，非常有利于達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。</p><p>　　D.甲醇:水=65%:35%</p><p>　　圖 3-7甲醇:水=65%:35% 色譜圖</p><p>　　如圖3-7所示，當(dāng)流動(dòng)相比例為65%:35%

52、時(shí)，可以看到圖3-6與圖3-7基本沒有太大差異，圖3-7中峰的高度及完整度與圖3-6相比更加完善，且圖3-7的峰更加孤立，目標(biāo)產(chǎn)物純度可以達(dá)到更高。但是與圖3-6相比，圖3-7的時(shí)間整整推遲了將近20分鐘，因此效率大大降低，不適合大量提純、制備，而純度提高并不是非常明顯。</p><p>　　從4幅圖譜中可以看出，圖3-4和圖3-5由于目標(biāo)物質(zhì)的峰沒有完全獨(dú)立出來，即使在這兩個(gè)流動(dòng)相比例下進(jìn)行收集還需要進(jìn)行二次甚

53、至三次操作才能提取出較高濃度的目標(biāo)產(chǎn)物；而圖3-6和圖3-7中的目標(biāo)峰完整，且峰形較好，并且為一個(gè)孤立整體，因此可以作為分離時(shí)的流動(dòng)相較為合適。而考慮到時(shí)間的問題，圖3-7的意義不是太大。</p><p>　　綜上所述，考慮時(shí)間、峰高、峰形、收集的純度等因素，最終決定為流動(dòng)相甲醇:水比例為67%:35%為最佳流動(dòng)相比例。在接下去的實(shí)驗(yàn)中，全部采用該最佳比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　3

54、.4.3 液相色譜的分析</p><p>　　確定最優(yōu)條件后，將高校液相色譜儀進(jìn)行相對(duì)調(diào)整，將其各個(gè)參數(shù)設(shè)定為：</p><p>　　1.波長(zhǎng)：254nm.</p><p>　　2.流動(dòng)相：色譜級(jí)甲醇和純凈水.</p><p>　　3.流量：3.0mL/min.</p><p>　　4.流動(dòng)相比例：甲醇:水=67%:3

55、3%</p><p>　　5.進(jìn)樣量：100μL</p><p>　　將29.5%的目標(biāo)分離物用少量色譜純甲醇溶解，并將色譜柱shim-pack-clc-ods(日本島津，16.0mm*150mm,粒徑5μm )換成SunFire Prep C18半制備柱（10mm*250mm,粒徑5μm）。</p><p>　　待高效液相色譜儀基線走穩(wěn)后，用液相微量注射器抽取樣品

56、100μL，進(jìn)行注射。并且在每隔10~15min進(jìn)行再次進(jìn)樣，以提高提取目標(biāo)物質(zhì)的效率。觀察并分析圖形，當(dāng)出現(xiàn)目標(biāo)峰時(shí)，通過導(dǎo)管，將液體接入到準(zhǔn)備好的玻璃儀器中，收集液體并妥善保存。重復(fù)以上步驟，直至所有分離液體注射完成。最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾并回收溶劑，檢測(cè)其純度。如諾純度不夠，繼續(xù)用高效色譜儀進(jìn)行再一次分離，直到目標(biāo)物純度超過85%。</p><p>　　3.4.4 組分純度測(cè)定</p>&l

57、t;p>　　將經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收的溶劑，取適量溶于水，在分析條件下進(jìn)樣，檢測(cè)純度。所得到的高效液相色譜圖如附錄圖4所示，可以看出，最終得到的目標(biāo)物質(zhì)純度為88.222%，超過預(yù)期目標(biāo)85%，成功實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　通過本次實(shí)驗(yàn)，基本成功從甲地孕酮中分離、提純出2α-甲基化雜質(zhì)，并且其最終濃度為88.222

58、%，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)85%，比較圓滿完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。而本次實(shí)驗(yàn)的核心儀器——高效液相色譜儀，其快速、精準(zhǔn)的從物化性質(zhì)相近的混合物中分離出目標(biāo)物質(zhì)的能力，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。從液相色譜的出現(xiàn)，到高效液相色譜的普及和發(fā)展，無論在色譜基礎(chǔ)理論、新的流動(dòng)相的使用、色譜柱的精細(xì)程度和儀器的研制和改進(jìn)，還是高效液相色譜實(shí)際應(yīng)用方面都有了很大程度上的提高?？梢韵胂螅S著不斷的進(jìn)步，液相色譜將在更多的領(lǐng)域里發(fā)揮出必不可少的作用，并和其他技術(shù)聯(lián)用，向

59、著高精度、高靈敏度、高效率、更加自動(dòng)化的方向發(fā)展。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 王志祥,莫芬珠,余國(guó)瓊. 制備型液相色譜分離技術(shù)進(jìn)展[J].化工時(shí)刊,1997,11(5):12-17.</p><p>　　[2] 王志祥,何志敏,余國(guó)琮. 制備型高效液相色譜中的質(zhì)量超載[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),19

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68、7-193.</p><p><b>　　附錄</b></p><p><b>　　圖1</b></p><p><b>　　圖2</b></p><p><b>　　圖3</b></p><p><b>　　圖4<