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文檔簡介
1、腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與腸道菌群、機(jī)體的遺傳因素和免疫反應(yīng)密切相關(guān)。腸道共生菌在一定條件下可以打破腸道內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài),誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,嚴(yán)重威脅人類和動物健康。腸道黏膜免疫系統(tǒng)在維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,探索腸道共生菌對腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制已成為當(dāng)前研究熱點之一。
大腸桿菌E.coli NC101和糞腸球菌E.faecalis是腸道共生菌,在人和動物的腸道均可分離得到。當(dāng)機(jī)體免疫功能正常時,其與機(jī)體和
2、諧共存;如果機(jī)體的免疫功能發(fā)生異常(如缺乏IL-10),會引發(fā)異常的腸道黏膜免疫反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉和腸炎。IL-10對調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)的平衡起著至關(guān)重要的作用。IL-10基因敲除小鼠是研究腸道黏膜免疫應(yīng)答的經(jīng)典動物模型,其免疫系統(tǒng)在無菌環(huán)境中處于靜息狀態(tài),但是在SPF環(huán)境中,在腸道共生茵的刺激下可以發(fā)生T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
本研究采用無菌級129品系野生型和IL-10基因敲除小鼠,開展了E.coli NC101單一感染產(chǎn)
3、生的IL-10對機(jī)體腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制研究;探索了單一感染E.coli NC101對C57B6品系IL-10基因敲除小鼠造成的腸組織病理變化及免疫應(yīng)答狀況;研究了ATG16L1、MyD88和NOD2基因在單一感染E.coli NC101時對抗原遞呈功能的影響;并分別從體外、體內(nèi)入手,研究了中藥成分對自發(fā)性腸炎的改善作用及其黏膜免疫機(jī)制。
試驗Ⅰ E.coH NC101感染活化機(jī)體產(chǎn)生的IL-10對黏膜免疫細(xì)胞因子
4、的調(diào)節(jié)作用研究
本試驗選用129品系無菌級野生型小鼠和IL-10基因敲除小鼠,研究腸道共生茵E.coli NC101單一感染對激活機(jī)體免疫反應(yīng),分泌細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用。首先進(jìn)行E.coli NC101單一感染,然后分別在感染前(0 d),感染后4d、7d和30d,分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞(MLN),應(yīng)用E.coli NC101細(xì)菌裂解液10μg/mL刺激MLN,ELISA檢測IFN-γ的分泌量;同時分離脾臟淋巴細(xì)胞,應(yīng)
5、用E.coli NC101細(xì)菌裂解液10μg/mL刺激未分離的淋巴細(xì)胞,ELISA檢測促炎性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的分泌量,以及結(jié)腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌產(chǎn)生的IL-12/23p40的水平。接著在129野生型小鼠單一感染E.coli NC101前,感染后4d、7d、14 d和30 d,分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞,應(yīng)用10μg/mL和1μg/mL的E.coli NC101細(xì)菌裂解液刺激MLN,ELISA檢測IFN-γ和IL-10的分泌
6、量;并檢測遠(yuǎn)端盲腸中IFN-γ和IL-10mRNA的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究IL-10對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,單一感染E.coli NC101后4d,在MLN培養(yǎng)時分別加入濃度為250 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL和2000 pg/mL的IL-10重組蛋白,檢測IL-10重組蛋白對MLN分泌IFN-γ的影響;并在單一感染E.coli NC101后7d和14d,通過在MLN培養(yǎng)時體外添加IL-10受體單克隆抗體阻斷IL-
7、10信號傳導(dǎo)通路,檢測其對MLN分泌IFN-γ的影響;同時進(jìn)行體內(nèi)阻斷IL-10信號傳導(dǎo)通路,ELISA檢測MLN分泌IFN-γ和IL-10的水平,及遠(yuǎn)端盲腸中IFN-γ和IL-10 mRNA的表達(dá)。
結(jié)果顯示:在單一感染的條件下,腸道共生菌E.coli NC101能夠激活129品系小鼠的腸道黏膜免疫應(yīng)答。野生型小鼠在單一感染4d時,IFN-γ在MLN和盲腸中的分泌與基因表達(dá)均達(dá)到最高水平,隨后顯著降低;IL-10基因敲除小鼠
8、在感染后的各個時間點均分泌大量IFN-γ。IFN-γ和IL-10 mRNA在盲腸中的表達(dá)與其在MLN中分泌水平的變化趨勢相同。體外添加IL-10重組蛋白可以降低IFN-γ在MLN中的分泌水平,體內(nèi)和體外阻斷IL-10信號傳導(dǎo)通路可以增加IFN-γ在MLN中的分泌水平。由此得出,單一感染腸道共生菌E.coli NC101的129小鼠在感染早期即可產(chǎn)生大量促炎癥細(xì)胞因子IFN-γ;單一感染刺激機(jī)體產(chǎn)生的IL-10,通過下調(diào)IFN-γ的分泌與
9、表達(dá),參與調(diào)節(jié)E.coli NC101對腸道黏膜的免疫應(yīng)答。
試驗Ⅱ單一感染E.coli NC101誘導(dǎo)C57B6 IL-10基因敲除小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)研究
應(yīng)用C57B6 IL-10基因敲除小鼠,每只小鼠通過灌胃給予0.2 mL菌液(OD600=0.9-1.0),研究單一感染E.coli NC101對C57B6 IL-10基因敲除小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)的影響。本試驗在感染前(0 d),感染后5w、10w、11w和12w分
10、別進(jìn)行組織學(xué)檢查,檢測單一感染是否對C57B6 IL-10基因敲除小鼠造成腸道損傷;同時檢測了未分離的脾臟淋巴細(xì)胞、腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞(MLN)在10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL的E.coli NC101細(xì)菌裂解液刺激下,炎性細(xì)胞因子的分泌量以及結(jié)腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌IL-12/23p40的水平;并通過CD4+T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞APC共培養(yǎng),檢測單一感染對C57B6 IL-10基因敲除小鼠腸道黏膜局部T細(xì)胞活化的影響。結(jié)
11、果顯示:在單一感染后5w、10w、11w和12w腸道組織學(xué)切片可見輕度的病理變化;腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌的IL-12/23p40在感染后各時間點與感染前相比差異顯著;單一感染后5w、10w、11w和12w,小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,在不同濃度E.coli NC101細(xì)菌裂解液的刺激下,分泌的IFN-γ均顯著高于感染前,單一感染后各時間點MLN在E.coli NC101細(xì)菌裂解液的刺激下分泌產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-17,且各時間點分泌量均顯著高于
12、感染前的水平。本試驗結(jié)果表明:在單一感染的條件下,E.coli NC101可以激活C57B6 IL-10基因敲除小鼠的腸道黏膜和全身性免疫應(yīng)答,并對腸道組織造成輕度的病理變化。單一感染E.coli NC101后,結(jié)腸自發(fā)分泌的IL-12/23p40、脾臟淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、APC和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)分泌的IFN-γ和IL-17顯著高于感染前。
試驗Ⅲ ATG16L1、MyD88扣NOD2基因調(diào)節(jié)細(xì)胞抗原遞呈功能的比較研
13、究
本試驗分別應(yīng)用C57B6背景的ATG16L1超等位基因小鼠、MyD88基因敲除小鼠和NOD2基因敲除小鼠,比較ATG16L1、MyD88和NOD2三種基因?qū)乖f呈功能的影響。試驗分三個部分:(1)應(yīng)用條件致病性腸道共生菌E.coliNC101和非致病性腸道共生菌E.coli K12研究不同基因來源的脾臟巨噬細(xì)胞對活細(xì)菌的吞噬作用,及活細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)24 h和48 h的存活情況及存活率。研究結(jié)果顯示:E.coli NC1
14、01在ATG16L1超等位基因小鼠和MyD88基因敲除小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率與E.coli K12相比,存在顯著差異;而在NOD2基因敲除小鼠中則沒有差異;與野生型小鼠相比,E.coli NC101在ATG16L1超等位基因小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率顯著高于其在野生型小鼠的存活率。(2)分離E.coli NC101單一感染的C57B6 IL-10基因敲除小鼠腸系膜淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞,并將上述三種不同基因小鼠脾臟抗原遞呈細(xì)胞APC
15、與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),通過ELISA檢測其分泌產(chǎn)生的IFN-γ和IL-17含量,來比較這些基因工程小鼠抗原遞呈功能與野生型小鼠的異同。結(jié)果顯示:三種不同基因來源的脾臟APC和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)分泌產(chǎn)生的IFN-γ和IL-17與野生型小鼠相比,沒有顯著差異。(3)基于上述試驗結(jié)果,選取骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)和樹突狀細(xì)胞(BMDC),進(jìn)一步研究ATG16L1超等位基因小鼠與野生型小鼠抗原遞呈功能的異同。分別用活細(xì)菌E.coli
16、NC101刺激2.5×105個細(xì)胞/孔、5.0×105個細(xì)胞/孔、7.5×105個細(xì)胞/孔和10.0×105個細(xì)胞/孔的BMDM,以及2.5×105個細(xì)胞/孔和5.0×105個細(xì)胞/孔的BMDC,通過ELISA檢測不同培養(yǎng)時間細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的水平。研究結(jié)果表明:BMDM在活細(xì)菌E.coli NC101的刺激下分泌產(chǎn)生大量的IL-10;其中,來源于ATG16L1超等位基因小鼠的BMDM分泌產(chǎn)生的I
17、L-10在各時間點均大于野生型,培養(yǎng)8h時各細(xì)胞濃度的分泌量均差異顯著;IL-12的分泌量在各時間點均小于野生型,培養(yǎng)12h時各細(xì)胞濃度的分泌量均差異顯著;而TNF-α的分泌量只有當(dāng)細(xì)胞量為10.0×105個/孔,培養(yǎng)6h時,顯著高于野生型小鼠的分泌量。BMDC在活細(xì)菌E.coli NC101的刺激下分泌產(chǎn)生大量IL-12;培養(yǎng)8h時來源于ATG16L1超等位基因小鼠的BMDC分泌產(chǎn)生的IL-12顯著低于野生型,而IL-10和TNF-α
18、的分泌量則與野生型小鼠沒有差異。以上試驗結(jié)果表明:ATG16L1基因功能損傷,可以增加細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的存活率,促進(jìn)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞活化,分泌細(xì)胞因子IL-10和IL-12。
試驗Ⅳ苦參堿對IL-10基因敲除小鼠自發(fā)性腸炎的治療作用及其黏膜免疫機(jī)制研究
本研究應(yīng)用SPF級別129 SvEv品系IL-10基因敲除小鼠,探討苦參堿是否可以減輕自發(fā)性腸炎的癥狀及其黏膜免疫機(jī)制。自發(fā)產(chǎn)生腸炎的IL-10基因敲除小鼠,每天
19、灌胃給予濃度為10 mg/kg苦參堿,對照組灌胃給予PBS對照,持續(xù)4w,每周檢測小鼠體重變化。小鼠分別在2w和4w處死,測量小鼠體重、結(jié)腸長度、結(jié)腸重量、組織學(xué)炎癥評分;檢測結(jié)腸自發(fā)分泌的IL-12/23p40、IFN-γ和IL-17的分泌量;腸系膜淋巴細(xì)胞在盲腸菌群裂解物刺激后IFN-γ和IL-17的分泌量;以及遠(yuǎn)端結(jié)腸中IFN-γ、 IL-17,IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)。此外,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了腸系膜T淋巴細(xì)胞中CD
20、4+和CD8+細(xì)胞所占比例。結(jié)果顯示:苦參堿組小鼠的體重逐漸恢復(fù),腸道組織學(xué)炎癥評分和結(jié)腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌的IL-12/23p40、IFN-γ和IL-17量顯著低于對照組小鼠??鄥A組小鼠腸系膜淋巴細(xì)胞中CD4+所占比例顯著低于對照組。此外,苦參堿組小鼠IFN-γ和IL-17在結(jié)腸組織中的mRNA表達(dá)顯著低于對照組。本試驗結(jié)果表明:苦參堿對于IL-10基因敲除小鼠自發(fā)性腸炎有良好的治療作用,苦參堿通過調(diào)整機(jī)體腸道黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng),發(fā)揮其
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