定量檢測(cè)豬天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的夾心ELISA方法.pdf

1、CD4+CD25+T細(xì)胞又稱作天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（natural regulatory T cell，nTreg），可限制效應(yīng)應(yīng)答的強(qiáng)度，另一方面，也可限制由過(guò)強(qiáng)抗感染免疫應(yīng)答所帶來(lái)的組織損傷。新近的研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子叉頭框P3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）被鑒定為nTreg發(fā)育和功能的主要調(diào)節(jié)器，也是nTreg迄今最特異的標(biāo)志。因此，建立檢測(cè)Foxp3快速、特異的方法尤為重要。
　　 根據(jù)豬Foxp3基因和大腸桿

2、菌的密碼子偏愛(ài)性，優(yōu)化并合成基因序列。在靶序列中，GC含量被調(diào)整到57.58％，不利基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)被去除，密碼子適應(yīng)指數(shù)從0.60上升到0.88，靶序列的異源表達(dá)水平被提升。PCR擴(kuò)增的靶序列被克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中。通過(guò)限制性酶切和測(cè)序，陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒被鑒定并且與所需序列相一致。約48KDa的融合蛋白被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，純化得到高純度的蛋白。
　　 通過(guò)用純化

3、的融合蛋白免疫新西蘭白兔，得到抗豬Foxp3的兔抗血清。最后一次免疫后，ELISA測(cè)得抗血清的效價(jià)約為1∶64000;免疫印跡分析顯示，抗血清能特異性地識(shí)別靶蛋白。Protein G親和層析純化抗血清得到IgG。SDS-PAGE結(jié)果證明，純化后的IgG由一個(gè)49.5KDa的重鏈和一個(gè)26.9KDa的輕鏈組成。
　　 用純化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠后，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。雜交瘤上清用間接ELISA篩檢特異性

4、抗體。獲得五株雜交瘤細(xì)胞2A4、2C4、3F3、4C8及4C11，能穩(wěn)定地培養(yǎng)并分泌抗豬Foxp3蛋白的單克隆抗體。所有單克隆抗體的Ig型均為IgG1，κ。腹水掃上清的ELISA效價(jià)分別為3.2×105、1.6×105、3.2×105、1.28×106、6.4×105和4.0×103、1.0×103、8.0×103、4.0×103、2.0×103。 ELISA和免疫印跡顯示，五株單克隆抗體均能與外周血淋巴細(xì)胞中的豬Foxp3和融合蛋白反

5、應(yīng)。SDS-PAGE的結(jié)果證明，純化的IgG由一個(gè)49.5KDa的重鏈和一個(gè)26.9KDa的輕鏈組成。
　　 研究了檢測(cè)豬Foxp3蛋白的間接夾心ELISA，并通過(guò)試劑稀釋優(yōu)化了試驗(yàn)條件。純化的單克隆抗體和多克隆抗體被用作包被抗體和檢測(cè)抗體，其最優(yōu)濃度分別是1.25μg/mL和0.9375μg/mL。酶標(biāo)抗體的最優(yōu)稀釋比例為1/6000。試驗(yàn)中各反應(yīng)成分不存在交叉反應(yīng)。最低檢測(cè)濃度為0.458 ng/mL。量效曲線的線性范圍為1

6、17.19-7.32 ng/mL。用最小二乘法證明OD值與Foxp3濃度間的簡(jiǎn)單線性相關(guān)性，關(guān)系為OD=0.0106[Foxp3]+0.1387，決定系數(shù)為0.9981。批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.89％和14.26％。根據(jù)臨床癥狀收集樣品，分為有病組和無(wú)病組，兩組都是正態(tài)分布，有病組和無(wú)病組的樣本量、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為17、108.82、85.77和27、167.54、89.97。單因素方差分析顯示兩組差異顯著(p＜0.05)。