冬蟲夏草菌子實(shí)體發(fā)育起始階段cDNA文庫的構(gòu)建及ESTs分析.pdf

1、本文從冬蟲夏草分類地位、資源分布、形態(tài)特征、化學(xué)成分等幾個(gè)方面闡述了目前冬蟲夏草研究的概況，針對(duì)目前在冬蟲夏草研究中有性過程很少研究的情況，提出了研究冬蟲夏草子實(shí)體發(fā)育這一關(guān)鍵問題的必要性;此外，文章還詳細(xì)闡述了EST技術(shù)的原理、方法、及應(yīng)用，從技術(shù)層面分析了本文研究方法的可行性與合理性。在此基礎(chǔ)上，明確了本研究的目的和意義，即通過系統(tǒng)的分子生物學(xué)的研究，揭示冬蟲夏草菌子實(shí)體發(fā)育啟動(dòng)過程中關(guān)鍵功能基因及其代謝調(diào)控的規(guī)律，為進(jìn)一步揭示其深

2、層次生物學(xué)奧秘奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究利用實(shí)驗(yàn)室建立的冬蟲夏草菌子實(shí)體人工培養(yǎng)技術(shù)體系，以分離自甘肅夏河縣扎油溝產(chǎn)冬蟲夏草的菌種為材料。分別在子實(shí)體發(fā)育啟動(dòng)前和子實(shí)體原基發(fā)育啟動(dòng)后取樣，用Hibind法提取總RNA，磁珠法分離mRNA，酶切改造克隆載體，SMART cDNA Library Construction Kit法構(gòu)建cDNA文庫，在檢驗(yàn)中間樣品和文庫合格后，挑選了文庫的數(shù)百個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)得的序列進(jìn)行深度分析，包

3、括:剔除污染序列，得到高質(zhì)量的EST序列，通過序列聚類的方法將同一基因的EST序列聚類在一起，然后把聚類的數(shù)據(jù)進(jìn)行序列拼接，得到一系列的單基因。然后，對(duì)上述單基因序列分別在NR和NT數(shù)據(jù)庫中做本地blast進(jìn)行基因注釋;對(duì)未知基因進(jìn)行開放閱讀框(ORF)的預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)的ORF在interpro數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和功能預(yù)測(cè)。用玉米赤霉作為背景，得到這些基因在生物過程，分子功能，細(xì)胞組件三個(gè)方面的聚類情況。此外將其與兩個(gè)文庫中的單基因高度

4、同源的基因作為KEGG數(shù)據(jù)庫的輸入進(jìn)行代謝通路的注釋和分析。最后，以上述分析結(jié)果為基礎(chǔ)，比較了冬蟲夏草菌在子實(shí)體發(fā)育啟動(dòng)前和啟動(dòng)后基因表達(dá)上的差異。重點(diǎn)對(duì)有差異的關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)以及功能進(jìn)行了深度分析。
　　結(jié)果顯示，本研究所獲得的總RNA，完整性好，純度高，由此分離的mRNA純度也合格。反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段完整性好。進(jìn)一步的全物種同源性序列比對(duì)分析表明，現(xiàn)有的序列與赤球叢赤殼，玉蜀黍赤霉和小麥冠腐病菌等同源性比較高。對(duì)沒有任何同源

5、序列的單基因進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，兩個(gè)文庫中各找了6條和5條編碼蛋白，它們中大部分都含有顯著的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域或者跨膜結(jié)構(gòu)。
　　對(duì)兩個(gè)文庫序列的同源基因進(jìn)行GO和代謝網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明，這些基因無論在產(chǎn)物的分子功能、生物過程還是生物代謝通路中，都發(fā)揮著重要的作用。KEGG中，無論文庫1和文庫2都在核小體結(jié)構(gòu)功能，電子傳遞鏈等代謝等通路上富集。
　　分析發(fā)現(xiàn)，在冬蟲夏草菌子實(shí)體發(fā)育啟動(dòng)過程中，有VeA基因和HSP70基因的特異表達(dá)