粘球菌子實(shí)體發(fā)育關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)控子DidR作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、粘球菌Myxococcus xanthus(M.xanthus)是一類(lèi)具有復(fù)雜社會(huì)學(xué)行為的革蘭氏陰性細(xì)菌。在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下，細(xì)胞通過(guò)分別稱作Social(S)運(yùn)動(dòng)和Adventurous(A)運(yùn)動(dòng)的雙運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)在固體介質(zhì)表面實(shí)現(xiàn)上滑動(dòng)運(yùn)動(dòng);在饑餓條件下，細(xì)胞通過(guò)群體運(yùn)動(dòng)形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)并分化成抗逆性的粘孢子以度過(guò)不良環(huán)境。粘細(xì)菌復(fù)雜的社會(huì)學(xué)行為與其復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)緊密相關(guān)。
　　 粘球菌的子實(shí)體形成包括單個(gè)細(xì)胞感知饑餓信號(hào)，群體細(xì)胞感

2、知饑餓信號(hào)和細(xì)胞聚集形成子實(shí)體并分化成抗逆性孢子三個(gè)主要流程。雙組份系統(tǒng)（twocomponent system，簡(jiǎn)稱TCS）是原核細(xì)胞中主要的信號(hào)感應(yīng)與傳導(dǎo)系統(tǒng)，可以識(shí)別胞外信號(hào)并調(diào)控下游相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄從而使細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。粘球菌基因組編碼有大量的TCS，它們組成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在枯球菌子實(shí)體發(fā)育等行為中發(fā)揮著重要作用。
　　 我們前期研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的含有典型的信號(hào)接受結(jié)構(gòu)域(REC)的蛋白，預(yù)測(cè)為雙組份系統(tǒng)

3、中的應(yīng)答調(diào)控蛋白或信號(hào)傳遞蛋白。它的缺失導(dǎo)致菌株表現(xiàn)出特殊的發(fā)育性狀，饑餓條件下菌體早期能夠聚集成不典型的子實(shí)體，但無(wú)法生成抗逆性孢子，我們命名為DidR(defective in developmental regulator)。那么，DidR在已知的粘球菌發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于怎樣的位置，又是如何發(fā)揮作用的呢？
　　 包括運(yùn)動(dòng)、胞外多糖(EPS)產(chǎn)生及發(fā)育生孢等能力在內(nèi)的突變體性狀分析顯示，與野生型菌株DK1622相比，敲除菌株

4、△MXAN1093的EPS產(chǎn)量升高，但運(yùn)動(dòng)能力無(wú)明顯變化，饑餓條件下菌體早期能夠聚集成不典型的子實(shí)體，但無(wú)法生成抗逆性孢子;對(duì)其磷酸化位點(diǎn)定點(diǎn)突變菌株D128N的分析顯示，其A及S運(yùn)動(dòng)能力均降低，饑餓條件下菌體早期聚集緩慢，后期無(wú)法生成抗逆性孢子。通過(guò)對(duì)比DK1622、△XAN1093和D128N的性狀，我們得到以下結(jié)論:(1)DidR蛋白的磷酸化位點(diǎn)的突變可能通過(guò)抑制EPS產(chǎn)生而抑制菌體運(yùn)動(dòng);(2)DidR蛋白的非磷酸化形式抑制發(fā)育早

5、期的聚集過(guò)程;(3) DidR的缺失影響孢子的生成。
　　 反轉(zhuǎn)錄PCR分析顯示didR與其上游基因MXAN1096-1094共轉(zhuǎn)錄，提示它們可能組成一個(gè)操縱子而發(fā)揮相同或相關(guān)功能。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示MXAN1096-1094均與脂多糖(LPS)核心多糖組分脫氧辛酸KDO的合成與激活有關(guān)，這意味著DidR也可能與LPS的合成相關(guān)。提取DK1622、△MXAN1093和D128N的LPS并進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)△MXAN10

6、93展現(xiàn)出與野生菌株DK1622不同的帶型，D128N與DK1662帶型基本相同。我們推測(cè)△MXAN1093的LPS可能部分受損，D128N的LPS不受影響，△MXAN1093的LPS具體發(fā)生了怎樣的變化仍需要進(jìn)一步的研究。另外，我們構(gòu)建了didR共轉(zhuǎn)錄基因kdsC(MXAN1094)敲除菌株△MXAN1094，該菌株與DK1622相比S運(yùn)動(dòng)降低但EPS產(chǎn)量升高，對(duì)該菌株的LPS進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該菌株的LPS受損。研究者們發(fā)現(xiàn)影響S運(yùn)動(dòng)主

7、要與四型pili、胞外多糖和脂多糖三類(lèi)基因有關(guān)，其中LPS核心多糖組分KDO對(duì)S運(yùn)動(dòng)的影響尚為空白。kdsC與KDO的激活相關(guān)，△MXAN1094敲除菌株的性狀說(shuō)明了LPS核心糖KDO與S運(yùn)動(dòng)的相關(guān)性。
　　 突變菌株性狀分析和基因組織分析為研究DidR的功能提供了一定的線索，為進(jìn)一步對(duì)DidR在發(fā)育通路中的位置進(jìn)行定位，有必要了解DidR是作為應(yīng)答調(diào)控蛋白還是磷酸化信號(hào)傳遞蛋白起作用。我們利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)對(duì)DidR的DNA結(jié)合