泰山柴雞三種禽腫瘤病病毒共感染的研究.pdf

1、馬立克氏病(Marek's Disease，MD)、禽白血?。ˋvian Leukosis，AL）和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)是家禽常見的病毒性腫瘤病。它們不僅能夠引發(fā)腫瘤和死亡，而且還能引起感染雞群的生產(chǎn)性能下降、免疫應(yīng)答水平降低、對其它疾病更易感等，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究通過對疑似腫瘤病感染的泰山柴雞進(jìn)行病毒的分離鑒定，從同一只雞體內(nèi)分離到了馬立克氏病病毒(Mar

2、ek's Disease Virus，MDV)、禽白血病病毒(Avian LeukosisVirus，ALV)及網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis Virus，REV);通過ELISA方法檢測ALV p27抗原確定雞群的ALV感染情況;采用PCR方法擴(kuò)增MDV的致瘤相關(guān)基因及ALV、REV的囊膜蛋白(env)基因，通過分析序列確定三種病毒的相關(guān)基因的特性及病雞存在不同亞型的ALV的共感染;最后，為驗證分離

3、到的病毒是否具有生物學(xué)活性，本研究進(jìn)行了動物回歸實驗，并從攻毒組的雞血液中成功分離鑒定出了這三種腫瘤病病毒。具體研究結(jié)果如下:
　　1三種腫瘤病病毒的分離鑒定
　　本研究根據(jù)病雞的臨床及剖檢癥狀，初步判定為腫瘤病感染，并進(jìn)行了病毒的分離鑒定。將病雞的白細(xì)胞接種雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)分離病毒，采用間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定出了MDV、ALV及REV。其中，用MDV單克隆抗體BA4、H19均得到了陽性的結(jié)果，其中H19單抗

4、的IFA結(jié)果陽性證明分離到的為強(qiáng)毒株MDV;利用J亞群ALV(ALV-J)的單克隆抗體JE9確定分離到了ALV-J，同時，用ELISA方法檢測采集的泰山柴雞雞群棉拭子及卵白樣品的ALV p27抗原，陽性率為65.5％(553/844)，結(jié)果表明泰山柴雞中存在較嚴(yán)重的ALV感染;用針對REV的單克隆抗體11B118檢測確定有REV感染。
　　通過病毒的分離及IFA鑒定發(fā)現(xiàn)同一只泰山柴雞體內(nèi)存在MDV、ALV及REV的共感染，命名為S

5、D110503。同時擴(kuò)增了三種腫瘤病病毒的相關(guān)基因，測序結(jié)果驗證了上述IFA結(jié)論，并且證實了存在不同亞型ALV的共感染。
　　2三種腫瘤病病毒相關(guān)基因序列分析
　　MDV meq、pp24及pp38基因序列分析結(jié)果表明，MDV meq、pp24及pp38基因與國內(nèi)外參考毒株序列的同源性分別為98.3％-99.0％、96.6％及98.1％-99.8％。分析堿基序列發(fā)現(xiàn)meq基因第575-577位的堿基為CAC，為強(qiáng)毒株的特征;

6、pp24基因序列第81位堿基為C，證明此株源于國外，最可能來自CVI988; pp38基因第320位堿基為G，對應(yīng)第107位氨基酸為精氨酸(R)，第326位堿基為G，對應(yīng)第109位氨基酸為甘氨酸(G)，為疫苗株。綜合上述堿基分析結(jié)果可判定此病毒為基因突變或者重組的強(qiáng)毒株。
　　ALV env基因序列分析顯示擴(kuò)增出的ALV-J(SD110503J) env基因與已發(fā)表的國內(nèi)外參考株env基因之間的同源性為84.1％-94.4％;進(jìn)化

7、樹的結(jié)果顯示SD110503J株與SD07LK01株的進(jìn)化關(guān)系最近;擴(kuò)增到的ALV-A(SD110503A、SD110503A1)env基因與已發(fā)表的ALV(A、B、C、D、E亞型)序列同源性為70.6-88.4％，基因進(jìn)化樹結(jié)果表明這擴(kuò)增出的兩個毒株與RSA-A的親緣關(guān)系最近，均為ALV-A;擴(kuò)增出來的ALV-C(SD110503C)毒株env基因與已發(fā)表的序列同源為82.5-95.2％，進(jìn)化樹結(jié)果顯示此毒株TW-3593株同源性最近

8、，本序列為ALV-C的gp85和ALV-E的gp37重組形成。上述結(jié)果表明，SD110503中存在不同亞型的ALV共感染，并且存在不同亞型之間基因重組現(xiàn)象。
　　REV env基因序列分析表明擴(kuò)增出來的SD110503REV env基因序列與已發(fā)表的REV序列同源性分別為94.4-99.3％，基因進(jìn)化樹結(jié)果表明此毒株與HLJR0901的親緣關(guān)系最近。
　　3動物回歸實驗
　　SD110503混合毒攻毒試驗結(jié)果可知，從攻