生物工程畢業(yè)論文-有機(jī)白蘿卜表皮附生乳酸_菌鏈霉素抗性分析

1、<p><b>　　畢 業(yè) 論 文</b></p><p>　　題 目:有機(jī)白蘿卜表皮附生乳酸菌鏈霉素抗性分析 </p><p>　　學(xué)院(直屬系): 食品與生物工程學(xué)院 </p><p>　　年級、專業(yè) : 2011 生物工程 </p><p>　

2、　學(xué) 生 姓 名: </p><p>　　學(xué) 號: 312011081801301 </p><p>　　指 導(dǎo) 教 師: </p><p>　　完 成 時(shí) 間: 2015年5月20日 </p><p><b&g

3、t;　　目 錄</b></p><p><b>　　摘 要1</b></p><p>　　Abstract2</p><p><b>　　1 前言3</b></p><p>　　1.1 抗生素的定義3</p><p>　　1.2 抗生素的用途簡介3

4、</p><p>　　1.3 蘿卜表皮附生乳酸菌3</p><p><b>　　1.4 鏈霉素4</b></p><p>　　1.5 16S rRNA分析技術(shù)在乳酸菌分類學(xué)的應(yīng)用4</p><p>　　1.6 本論文研究的目的及意義5</p><p><b>　　2 材料和方法

5、5</b></p><p>　　2.1 材料和儀器5</p><p>　　2.1.1 樣品5</p><p>　　2.1.2 試劑6</p><p>　　2.1.3 儀器7</p><p>　　2.1.4 培養(yǎng)基及配制7</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法8</p

6、><p>　　2.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)8</p><p>　　2.2.2 乳酸菌的分離純化8</p><p>　　2.2.3 乳酸菌總DNA的提取9</p><p>　　2.2.4 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增及克隆分析9</p><p>　　2.2.5 最小抑制濃度（MIC）的測定12</p>

7、;<p><b>　　3 結(jié)果12</b></p><p>　　3.1 乳酸菌的分離12</p><p>　　3.2 基因組DNA的提取13</p><p>　　3.3 16S rRNA的PCR擴(kuò)增片斷電泳結(jié)果分析13</p><p>　　3.4 重組子的篩選和鑒定14</p>&l

8、t;p>　　3.5 16S rRNA分析16</p><p>　　3.6 鏈霉素抗性分析結(jié)果17</p><p><b>　　4 結(jié)論19</b></p><p><b>　　總結(jié)與體會20</b></p><p><b>　　致謝詞21</b></p&g

9、t;<p><b>　　參考文獻(xiàn)22</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　以市售的有機(jī)白蘿卜為研究對象，分析其表皮附生的乳酸菌對鏈霉素的抗藥性。分離菌株的16S rRNA和抗藥性分析表明：從有機(jī)白蘿卜表皮分離得到的43株菌分別屬于Pediococcus pentosaceus（44%）、L

10、euconostoc mesenteroides（16%）、Leuconostoc pseudomesenteroides（5%）、Leuconostoc citreum（16%）、Leuconostoc holzapfelii（14%）和Weissella cibaria（5%）。在分離得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表現(xiàn)出了對鏈霉素的抗藥性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P(guān). pentosaceus中，有5株菌表現(xiàn)出對鏈霉

11、素的抗藥性；L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides對鏈霉素都表現(xiàn)為敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分別有一株菌表現(xiàn)出對鏈霉素的抗藥性。</p><p>　　【關(guān)鍵詞】有機(jī)白蘿卜；乳酸菌；鏈霉素；抗藥性</p><p><b>　　Abstract</b></p><

12、;p>　　The epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were investigated by MRS culture, 16S rRNA and antibiotic resistance. 43 isolates in current study were assigned to Pediococcus pentosaceu

13、s (44%), Leuconostoc mesenteroides (16%), Leuconostoc pseudomesenteroides (5%), Leuconostoc citreum (16%), Leuconostoc holzapfelii (14%) and Weissella cibaria (5%). And 8 (18.6%) isolates displayed the resistance of stre

14、ptomycin. Among the Pediococcus pentosaceus, there were 5 isolates r</p><p>　　Keywords: Organic white radish; Lactobacillus; streptomycin; resistance</p><p><b>　　1 前言</b></p>

15、<p>　　白蘿卜是根菜類的主要蔬菜，屬十字花科、蘿卜屬的一年或二年生草本雙子葉植物[1]。在我國白蘿卜栽培歷史悠久，是一種藥食同源的大眾化蔬菜，富含維生素C、芥子油、淀粉酶和粗纖維，具有促進(jìn)消化，增強(qiáng)食欲，加快胃腸蠕動(dòng)和止咳化痰的作用，可以治療或輔助治療多種疾病，為食療佳品，被本草綱目稱之為“蔬中最有利者”，因此常被作為水果而鮮食[1]。乳酸菌是蔬菜表面常見的附生微生物，長期以來被普遍認(rèn)為是安全[2]。然而，近年來越來越多抗

16、生素抗藥性乳酸菌被發(fā)現(xiàn)具有一定可轉(zhuǎn)移的抗藥性，為乳酸菌的安全敲響了警鐘。</p><p>　　1.1 抗生素的定義</p><p>　　抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。現(xiàn)臨床常用的抗生素有轉(zhuǎn)基因工程菌[3] 培養(yǎng)液液中提取物以及用化

17、學(xué)方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下萬種。</p><p>　　1.2 抗生素的用途簡介</p><p>　　抗生素以前被稱為抗菌素，事實(shí)上它不僅能殺滅細(xì)菌而且對霉菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次氏體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，通常將抗菌素改稱為抗生素?？股乜梢允悄承┪⑸锷L繁殖過程中產(chǎn)生的一種物質(zhì)，用于治病的抗生素除由此直接提取外；還有完全用人工合成或部

18、分人工合成的。通俗地講，抗生素就是用于治療各種非病毒感染的藥物。 但是在臨床使用中已經(jīng)顯現(xiàn)了許多副作用。</p><p>　　1.3 蘿卜表皮附生乳酸菌</p><p>　　乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱，它屬于發(fā)酵糖類，其主要產(chǎn)物為乳酸。乳酸菌是一群細(xì)菌，它們數(shù)量相當(dāng)龐大，種類異常復(fù)雜，到目前為止共發(fā)現(xiàn)有200多種，并分成了18個(gè)

19、屬。其中相當(dāng)大的一部分都是我們?nèi)梭w所必須并具有重要生理功能的菌，而且人體的腸道中大量存在著這些菌。并且國內(nèi)外生物學(xué)家都認(rèn)為人類身體的健康程度和生命的長短都與腸道中的乳酸菌有著非常密切的關(guān)系。</p><p>　　乳酸菌的發(fā)酵原理是：乳酸菌進(jìn)行無氧呼吸，葡萄糖即經(jīng)過糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸再脫氫產(chǎn)生乳酸。乳酸菌可將酪蛋白被分解成肽和氨基酸，而且乳糖和檸檬酸可生成芳香性物質(zhì)，從而產(chǎn)生風(fēng)味。乳酸球菌和乳酸桿菌對蛋白質(zhì)有

20、較強(qiáng)的分解能力，是高酸生成菌。乳酸菌還有分解脂肪的能力，三丁酸甘油酯易被乳酸菌發(fā)酵劑分解。</p><p><b>　　1.4 鏈霉素</b></p><p>　　鏈霉素屬于抗生素中氨基糖苷類。</p><p>　　鏈霉素（streptomycin）是一種氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。 1943年美國 S.A.瓦克

21、斯曼從鏈霉菌中析離得到，是繼青霉素后第二個(gè)生產(chǎn)并用于臨床的抗生素。它的抗結(jié)核桿菌的特效作用，開創(chuàng)了結(jié)核病治療的新紀(jì)元。鏈霉素是一種從灰鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取的抗菌素。屬于氨基糖甙堿性化合物，它與結(jié)核桿菌菌體核糖核酸蛋白體蛋白質(zhì)結(jié)合，起到了干擾結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)合成的作用，從而殺滅或者抑制結(jié)核桿菌生長的作用。鏈霉素為白色無定形粉末，有吸濕性。易溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。硫酸鏈霉素制劑外觀為黃色粉末，密度0.38g/L

22、，pH1.5～3.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下易失效。</p><p>　　1.5 16S rRNA分析技術(shù)在乳酸菌分類學(xué)的應(yīng)用</p><p>　　16S ribosomal RNA是16S rRNA 的全名，它是原核生物的一種核糖體RNA，是原核核糖體30S小亞基的組成部分。由于其種類少，普遍性存在，分子大小適中，總量一般占細(xì)菌rRNA總量的80 %左右，

23、在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性和特異性，基因序列一般包含約50個(gè)功能域，基因序列的變化緩慢，所以將16S rRNA 用作分子指標(biāo), 這樣能實(shí)現(xiàn)微量、快速、準(zhǔn)確、簡便的對乳酸菌進(jìn)行分類鑒定。16S rRNA中的"S"是沉降系數(shù)，反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個(gè)指標(biāo)。此沉降系數(shù)分為3種：5S、16 S和23 S，他們對應(yīng)的編碼基因（rRNA）的鏈長為3300、1540、120個(gè)核苷酸，細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成過程是由它

24、們和核糖體大小亞基組合在一起共同完成的。16S rRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。</p><p>　　16S rRNA 基因片段一般有3 種分析方法: 第一種是，將PCR 產(chǎn)物與16S rRNA 種屬特異性的探針雜交，從而獲取微生物組成信息。樣品與探針也可以直接進(jìn)行原位雜交檢測，這樣既能分析它們的空間分布，還能測定微生物的豐度和形態(tài)特征。此方法優(yōu)點(diǎn)是簡潔方便， 通常大

25、量應(yīng)用于快速檢測,。缺點(diǎn)是可能出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。第二種是在質(zhì)粒載體上將PCR 產(chǎn)物克隆，然后進(jìn)行測序。通過將結(jié)果與16S rRNA 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較的方法，找出它在進(jìn)化樹中的位置，這樣就可以鑒定出蘿卜表面乳酸菌中存在的乳酸菌種類,。此方法優(yōu)點(diǎn)是獲得的信息比較全,缺點(diǎn)是如果成分太復(fù)雜，工作量會很大。第三種是，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism

26、 s,RFLP)分析, 然后觀察其酶切電泳圖譜和數(shù)值分析來確定蘿卜表面乳酸菌基因的核糖體型, 然后與核糖體庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，這樣可以分析不同種屬之間的關(guān)系。</p><p>　　隨著分子分類的方法和理論的日漸成熟，16S rRNA分析技術(shù)成為了微生物分類學(xué)研究的一種可靠的工具。細(xì)菌主要是根據(jù)是細(xì)菌生理、生化性狀和形態(tài)特征進(jìn)行分類, 采用的對乳酸菌進(jìn)行純培養(yǎng)分離方法，然后鑒定其生理、生化、形態(tài)、反應(yīng)特征和免疫學(xué)特

27、性[4-5]。</p><p>　　1.6 本論文研究的目的及意義</p><p>　　隨著人們生活水平逐步提高，人們越來越重視食品安全問題。有機(jī)蔬菜純天然、不含任何農(nóng)藥殘留，通常被稱為“零污染”的蔬菜，因此備受消費(fèi)者青睞。然而，近年來越來越多抗生素抗藥性乳酸菌被發(fā)現(xiàn)具有一定可轉(zhuǎn)移的抗藥性，為乳酸菌的安全敲響了警鐘。該研究以期待為有白機(jī)蘿卜鮮食的食品安全評價(jià)提供參考。</p>

28、<p><b>　　2 材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 材料和儀器</b></p><p><b>　　2.1.1 樣品</b></p><p>　　有機(jī)白蘿卜樣品購買于成都有機(jī)蔬菜種植基地零售超市。</p><p><b>　　2

29、.1.2 試劑</b></p><p>　　2.1.2.1 DNA提取與檢測試劑</p><p>　　表1 DNA提取與檢測試劑</p><p>　　2.1.2.2 PCR擴(kuò)增試劑</p><p>　　表2 PCR擴(kuò)增試劑</p><p>　　2.1.2.3 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增<

30、/p><p>　　表3 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增試劑</p><p><b>　　2.1.3 儀器</b></p><p>　　表4 實(shí)驗(yàn)所用儀器及設(shè)備</p><p>　　2.1.4 培養(yǎng)基及配制</p><p>　　2.1.4.1 MRS培養(yǎng)基配制方法（配制量1 L）</p&

31、gt;<p>　　(1) 稱取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐溫80 1mL，檸檬酸銨2g，乙酸鈉5g，硫酸錳0.05g，硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鉀2g，碳酸鈣20g于1 L的燒杯中；</p><p>　　(2) 加入約800mL（80%）去蒸餾水，加熱充分?jǐn)嚢枞芙猓?lt;/p><p>　　(3) 滴加1mol/LNaOH，調(diào)節(jié)pH至6.5~6.8；

32、</p><p>　　(4) 加去蒸餾水至1L；</p><p>　　(5) 加入15g瓊脂，高溫高壓滅菌（121℃滅菌30min），待冷卻至60℃左右時(shí)搖勻倒平板，每個(gè)平板的培養(yǎng)基加20mL左右，平板制成后保存于4℃。</p><p>　　2.1.4.2 MRS液體培養(yǎng)基</p><p>　　(1) 稱取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏

33、10g，葡萄糖20g，吐溫80 1mL，檸檬酸銨2g，乙酸鈉5g，硫酸錳0.05g，硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鉀2g于1L的燒杯中；</p><p>　　(2) 加入約800mL（80%）蒸餾水，加熱充分?jǐn)嚢枞芙猓?lt;/p><p>　　(3) 滴加1mol/LNaOH，調(diào)節(jié)pH至6.5~6.8；</p><p>　　(4) 加蒸餾水至1L，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，分裝入試管中

34、（5mL/支）；</p><p>　　(5) 高溫高壓滅菌（121℃滅菌30min），保存。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)</p><p>　　隨機(jī)選取有機(jī)白蘿卜表皮25 g放于225 mL無菌生理鹽水中，振蕩30 min，制成細(xì)菌原液。用移液槍取90

35、0μl無菌水于EP管中，再取100μl細(xì)菌原液，混合均勻記為1:10；吸取1:10的細(xì)菌液于900μl無菌水中混勻制成1:100細(xì)菌液；吸取1:100的細(xì)菌液于900μl無菌水中混勻制成1:1000細(xì)菌液; 吸取1:1000的細(xì)菌液900μl無菌水中混勻制成1:10000細(xì)菌液。</p><p>　　配制液體MRS培養(yǎng)基200mL，滅菌后倒10個(gè)平板，待其冷卻凝固后于恒溫箱過夜，用移液槍取100μl菌種于平板，用

36、玻璃涂棒將菌種涂均勻，作好標(biāo)記，每個(gè)濃度的細(xì)菌液接兩個(gè)平板，于37℃恒溫箱培養(yǎng)48h[6]。</p><p>　　2.2.2 乳酸菌的分離純化</p><p>　　在MRS固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，將菌種稀釋至合適的濃度，均勻涂布于加入碳酸鈣后的固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培育48h。乳酸菌會在含有碳酸鈣的培養(yǎng)基上產(chǎn)生溶解圈，觀察挑選有碳酸鈣溶解圈的單菌落（最好挑一些溶解圈半徑較大的），然后在MR

37、S 固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線，直到分離長出單菌落。將分離的單菌落編號菌種在MRS固體培養(yǎng)基上，保藏溫度4℃，備用。</p><p>　　2.2.3 乳酸菌總DNA的提取</p><p>　　(1) 將已培養(yǎng)至飽和的細(xì)菌液吸取2.0mL，10000rpm離心2min，棄上清，加ddH2O無菌水洗滌，10000rpm離心2min，棄上清；</p><p>　　(2) 沉淀物

38、加入555 μl TE buffer，充分懸?。ú荒苡芯鷪F(tuán)），加入40 μl 10％ SDS和5 μl20 mg/mL蛋白酶K，懸振混勻，37℃溫育1h；</p><p>　　(3) 加入100μl 5M的 NaCl，混勻，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，70℃溫育10 min；</p><p>　　(4) 加入780μl 24∶1氯仿/異戊醇，混勻，4℃，12000rpm離

39、心5min，上清液轉(zhuǎn)入新管中，棄廢管；</p><p>　　(5) 加入等體積的25∶24∶1 酚/氯仿/異戊醇（注意取下層溶液），混勻，4℃，12000rpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)入新管中，棄廢管；</p><p>　　(6) 加入0.6體積的異丙醇，輕輕混勻，4℃靜止2h，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，500μl70％乙醇洗滌，4℃，12000rpm離心10min，棄上

40、清；</p><p>　　(7) 真空干燥10min，加入TE buffer 30μl溶解，-20℃保存[7]。</p><p>　　2.2.4 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增及克隆分析</p><p>　　2.2.4.1 16S rRNA目的基因的PCR擴(kuò)增</p><p><b>　　(1) PCR引物</b>

41、</p><p>　　Forward Primer：Eu27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，10μM )；</p><p>　　Reverse Primer：1490R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，10μM)；</p><p><b>　　(2) PCR反應(yīng)</b></p><

42、;p>　　16S rRNA 序列的PCR反應(yīng)體系（50μl）如表5</p><p>　　表5 16S rRNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系</p><p>　　按以下程序在PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀中對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增：</p><p>　　95℃預(yù)熱 5 min</p><p>　　95℃變性1 min</p><p>　　50

43、℃退火1 min 35 cycles</p><p>　　72℃延伸2 min</p><p>　　72℃延伸10 min</p><p>　　反應(yīng)結(jié)束后，－20℃保存。</p><p>　　(3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物</p><p>　　取PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物5 μl，加1 μl 6 × l

44、oading buffer混勻，上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測擴(kuò)增效果。DNA Marker VII 5 μl作標(biāo)準(zhǔn)，1 × TAE緩沖液介質(zhì)，4 ~ 10 V/cm直流電電泳。</p><p>　　2.2.4.2 連接反應(yīng)（Ligation)和重組DNA的轉(zhuǎn)化</p><p>　　從PGM-T ligation Kit劑盒（Tiangen公司）1 μl連接緩沖液加入到20

45、0 μl的Eppendorff 管中。然后加入擴(kuò)增后的DNA片段4 μl，再加入pGM-T載體 1 μl ，再加入3 μl ddH2O，T4 DNA ligase 1 μl輕輕混勻后（注：以上添加溶液順序不能顛倒）在PCR儀中16℃過夜連接。連接結(jié)束后取3 μl重組質(zhì)粒DNA加入到冰上已解凍的裝有感受態(tài)大腸桿菌DH5α Eppendoff 管中，輕輕混勻，冰上放置30 min，42℃熱激90s，迅速置冰水浴中2 min，加入已經(jīng)在37℃

46、預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基300~500 μl，37℃搖床培養(yǎng)45 min。</p><p>　　2.2.4.3 重組菌落的篩選</p><p>　　向含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)皿中加入40 μl X-gal和30 μl IPTG后涂布平板，37℃放置1~3 h，加入100 μl重組大腸桿菌液涂在LB平板上。Eppendoff管中剩余的400 μl重組大腸桿菌DH5α在4℃ 12000 rp

47、m下離心 1 min，倒掉上清液約300 μl，微型震蕩儀上懸震菌體沉淀，吸取菌懸液涂于新的LB平板。涂好后的平板在37℃培養(yǎng)15 h左右，挑選白色的菌落。</p><p>　　2.2.4.4 重組大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)</p><p>　　將LB液體培養(yǎng)基分裝入試管中，每管約4 mL，121℃，滅菌20 min，冷卻后每管加入5 μl氨芐青霉素（25 mg/mL）。用無菌牙簽挑取白色的單菌落

48、接種于試管中，37℃，150 rpm震蕩培養(yǎng)15~18 h，直至從試管另一面看不到牙簽即可。</p><p>　　2.2.4.5 重組質(zhì)粒的提取和鑒定</p><p>　　質(zhì)粒的提取參見質(zhì)粒小提試劑盒（Omega公司）的說明操作，步驟如下：</p><p>　　(1) 柱平衡步驟：向吸收柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12000 rpm

49、離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　　(2) 取1.5 mL在2.2.4.4中培養(yǎng)的大腸桿菌，加入到Eppendorf管中，使用普通離心機(jī)，12000 rpm離心1分鐘，盡量去除上清液。</p><p>　　(3) 向留有菌體沉淀的Eppendorf管中加入250 μl溶液P1（先確認(rèn)是否已加入RNaseA），使用旋渦混勻器徹底懸浮菌體沉淀。<

50、;/p><p>　　(4) 向Eppendorf管中加入250 μl溶液P2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)4-6次使菌體充分裂解。</p><p>　　(5) 向Eppendorf管中加入350 μl溶液P3，立即上下翻轉(zhuǎn)，充分的混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000 rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。</p><p>　　(6) 小心的將上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到吸附柱CB

51、3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。室溫放置1~2分鐘，12000 rpm離心30 ~ 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。</p><p>　　(7) 向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW（先確認(rèn)是否已加入無水乙醇），12000 rpm，離心30 ~ 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新裝入收集管中。</p><p>　　(8) 向吸附柱CB3中

52、加入500 μl漂洗液PW，12000 rpm（-13400×g）離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。</p><p>　　(9) 將吸附柱重新裝入收集管中，12000 rpm離心2分鐘。</p><p>　　(10) 將吸附柱CB3放置于一個(gè)干凈的Eppendorf管中，向吸附膜的中央部分滴加50 ~ 100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放置1分鐘，12000 rpm（-1340

53、0×g）離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到Eppendorf管中。</p><p>　　(11) 為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入帶有吸附柱的Eppendorf管中，重復(fù)（10）的操作。</p><p>　　(12) 將上面收集到的質(zhì)粒DNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　(13) 限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒DNA：在1.5 mL的Eppendor

54、f管中加入滅菌水1.5 μl/管、酶EcoR I 1 μl/管，然后再加入質(zhì)粒DNA 2 μl/管，用手指輕輕彈勻，小型離心機(jī)上離心使管壁上的液體落入管底，37℃酶切1 h，電泳檢測。</p><p>　　2.2.4.6 DNA序列的測定</p><p>　　該部分送往成都博瑞克生物技術(shù)有限公司完成。</p><p>　　2.2.5 最小抑制濃度（MIC）的測定&

55、lt;/p><p>　　根據(jù)歐洲抗微生物藥物敏感委員會關(guān)于微生物對不同抗生素敏感閾值X的數(shù)據(jù)庫分析菌株的抗生素抗藥性。當(dāng)分離菌株的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimal Iinhibitory Concentration, MIC)≤ Xμg/mL時(shí)為敏感性菌株，反之當(dāng)MIC>Xμg/mL為抗藥性菌株。</p><p>　　最小抑制濃度的測定采用微量肉湯稀釋法。</p><

56、p>　　培養(yǎng)液制備：在2mL MRS液體培養(yǎng)基中接種從平板上挑取的單菌落，然后在30℃環(huán)境中靜止培養(yǎng)過夜，然后用生理鹽水稀釋至每毫升1×107 個(gè)細(xì)胞的濃度，即得到培養(yǎng)液。</p><p>　　將STR配制成2048μg/mL的貯存液，MRS液體培養(yǎng)基2倍梯度稀釋成使用液。STR的梯度稀釋濃度為2~1024μg/mL。向96孔板中加入198μL含不同濃度抗生素的MRS液體培養(yǎng)基后，接種2μL分離菌

57、株的培養(yǎng)液（1×107CFU/mL），37℃靜止培養(yǎng)24h后，統(tǒng)計(jì)不同菌株的MIC，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并設(shè)置空白對照。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 乳酸菌的分離</p><p>　　乳酸菌是指發(fā)酵時(shí)能夠產(chǎn)生乳酸的一大類細(xì)菌，包括40個(gè)屬，近300個(gè)種。MRS平板分離乳酸菌時(shí)，利用其產(chǎn)生的乳酸

58、溶解CaCO3形成溶鈣圈的特性，實(shí)現(xiàn)乳酸菌的初步分離。在當(dāng)前研究中，從平板中分離得到43個(gè)溶鈣圈菌落，編號為為LS1到LS43。</p><p>　　3.2 基因組DNA的提取</p><p>　　DNA作為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ),在生物領(lǐng)域尤其是遺傳學(xué)方面的研究日漸深入，在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的基因工程技術(shù)已在醫(yī)藥、畜牧業(yè)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。研究和應(yīng)用DNA的基礎(chǔ)是提取純化結(jié)構(gòu)完整的DNA，實(shí)驗(yàn)中

59、將SDS法和CTAB法結(jié)合用于DNA的提取，不僅能使微生物細(xì)胞能更完全的得到破碎，并有利于蛋白質(zhì)等雜質(zhì)與DNA的分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。</p><p>　　圖3 Wide Range DNA Marker 圖4 部分乳酸菌的總DNA電泳結(jié)果圖</p><p>　　由圖4可看出每條泳道均出現(xiàn)清晰的條帶且與Marker的條帶基本一致。實(shí)驗(yàn)中染色劑Gold-v

60、iew中所含有的EB嵌入核酸雙鏈的堿基之間，形成EB-DNA復(fù)合物。該復(fù)合物，經(jīng)紫外光照射，可以發(fā)出紅-橙色的熒光。1 ng的DNA即可檢出。由電泳亮斑可知，細(xì)菌基因組DNA的大小超過12 kb，因此，則可認(rèn)為達(dá)到了對基因組DNA的提取要求。</p><p>　　3.3 16S rRNA的PCR擴(kuò)增片斷電泳結(jié)果分析</p><p>　　所有樣本菌的16S rRNA基因皆進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)

61、增后電泳檢測的結(jié)果如圖6所示。</p><p>　　圖5 DNA Marker III 圖6 16S rRNA的PCR擴(kuò)增電泳圖（部分） </p><p>　　由圖6電泳亮斑可知，對所有樣本菌的16S rRNA基因皆進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增片段的大小在1200 ~ 2000 bp之間，和原核生物的16S rRNA基因片段大小一致，因此達(dá)到了

62、對微生物的16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增目的[8]。</p><p>　　3.4 重組子的篩選和鑒定</p><p>　　以Taq DNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)堿基A，pGM-T載體，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖7所示，具有一個(gè)T堿基的粘性末端，它們既可按堿基互補(bǔ)配對原則，將目的片段與載體相連，構(gòu)建成重組子。</p><p>　　pGM-T載體不僅含有多克隆酶切

63、位點(diǎn)，還含絲狀噬菌體f1的復(fù)制起始區(qū)，用于產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA；含有T7和SP6 DNA聚合酶啟動(dòng)子；在多克隆區(qū)域具有編碼β-半乳糖苷酶的基因（lacZ），插入失活α-肽可在指示平板上通過藍(lán)、白菌落直接篩選重組菌落。</p><p>　　圖7 pGM-T結(jié)構(gòu)圖譜</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用了內(nèi)切酶EcoRⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行了切割，EcoRⅠ酶的切位點(diǎn)如圖8所示。陽性重組子經(jīng)酶切后有16S

64、 rRNA目的基因片段電泳亮斑，并和DNA Marker Ⅶ中長度為1.5 kb的核酸片段亮斑位置相一致。由檢測圖10可知，連接反應(yīng)已將PCR擴(kuò)增后的16S rRNA基因連接到了T-載體上，并在感受態(tài)菌株E.coli DH5α中得到了表達(dá)，形成白色菌落。</p><p>　　圖8 EcoRⅠ酶切示意圖 </p><p>　　圖9 DNA Marker Ⅶ

65、 圖10 酶切后的質(zhì)粒電泳圖（部分）</p><p>　　3.5 16S rRNA分析</p><p>　　通過16S rRNA序列經(jīng)校對后，與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫做相似性分析，選取相似度較高的菌株將結(jié)果記錄如表6。Stackebrandt[9]等認(rèn)為當(dāng)細(xì)菌的16S rRNA序列的相似性大于或等于97%時(shí)，則可以認(rèn)為是同一個(gè)屬

66、，當(dāng)序列相似性大于或等于98%時(shí)，可以認(rèn)為是同一個(gè)種。從平板上分離得到的43株菌通過16S rRNA序列分析結(jié)果表明：有機(jī)白蘿卜表皮附生乳酸菌主要分為Pediococcus、Leuconostoc和Weissella屬（表6），其中，以LS5為代表的19株分離菌株屬于Pediococcus屬，它們的16S rRNA序列與P. pentosaceus DSM 20336T 的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS5為代表的19株菌

67、被鑒定為P. pentosaceus，占所有菌株的44%；以LS2為代表的7株菌屬于Leuconostoc屬，它們的16S rRNA序列與L. mesenteroides ATCC 8293T的16S rRNA序列相似性為99%，因此以LS2為代表的7株菌被鑒定為L. mesenteroides，占所有菌株的16%；以LS15為</p><p>　　表6 16S rRNA序列比對結(jié)果</p>&l

68、t;p>　　3.6 鏈霉素抗性分析結(jié)果</p><p>　　查詢歐洲抗微生物藥物敏感委員會 (http://www.eucast.org)關(guān)于微生物對不同抗生素敏感閾值的數(shù)據(jù)庫（http://www.eucast.org/mic_distributions/）可知，P. pentosaceus、L. mesenteroides、L. pseudomesenteroides、L. citreum、L. hol

69、zapfelii和W. cibaria對鏈霉素的敏感閾值分別是64、64、64、64、64和8；在分離得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表現(xiàn)出了對鏈霉素的抗藥性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P(guān). pentosaceus中，有5株菌表現(xiàn)出對鏈霉素的抗藥性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides對鏈霉素都表現(xiàn)為敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分

70、別有一株菌表現(xiàn)出對鏈霉素的抗藥性。</p><p>　　表7 有機(jī)白蘿卜表皮附生乳酸菌對鏈霉素的MIC與抗藥性(μg/mL)</p><p>　　注：“R” 代表耐藥，“S”代表敏感</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　從有機(jī)白蘿卜表皮分離得到的43株菌分別屬于Pediococcus、Le

71、uconostoc和Weissella屬，其中，19株菌被鑒定為P. pentosaceus，占所有菌株的44%；7株菌被鑒定為L. mesenteroides，占所有菌株的16%；2株菌被鑒定為L. pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；7株菌被鑒定為L. citreum，占所有菌株的16%；6株菌被鑒定為L. holzapfelii，占所有菌株的14%；2株菌被鑒定為W. cibaria，占所有菌株的5%。在分離

72、得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表現(xiàn)出了對鏈霉素的抗藥性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P(guān). pentosaceus中，有5株菌表現(xiàn)出對鏈霉素的抗藥性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides對鏈霉素都表現(xiàn)為敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分別有一株菌表現(xiàn)出對鏈霉素的抗藥性。</p><p><b>　　總結(jié)

73、與體會</b></p><p>　　通過本次論文，我很好的總結(jié)了四年大學(xué)的學(xué)習(xí)，并將所學(xué)的知識很好的應(yīng)用到了實(shí)驗(yàn)中，對自己的理論應(yīng)用能力有了很好的鍛煉和提高。畢業(yè)設(shè)計(jì)不僅是對大學(xué)前三年所學(xué)知識的檢測，也是對自己的思維和實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ囊环N鍛煉，并使之有所提高。通過這次畢業(yè)設(shè)計(jì)我發(fā)現(xiàn)原來自己學(xué)的知識是比較有限的，而且真正要自己設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，并親手把它做出來，是已經(jīng)很不容易的事，還需要學(xué)習(xí)的東西很多。在實(shí)驗(yàn)過程

74、中遇到了很多困難，一開始不知道怎么下手，通過指導(dǎo)老師和師兄的幫助，我漸漸進(jìn)入了畢業(yè)設(shè)計(jì)的正軌。我也明白了：知識必須通過應(yīng)用才能實(shí)現(xiàn)其價(jià)值，學(xué)以致用，是一個(gè)提升的過程。這次畢業(yè)設(shè)計(jì)既鍛煉了自己獨(dú)立思考的能力、與人合作的能力和應(yīng)對困難的心理，還在理論知識和實(shí)驗(yàn)技能上得到了提高。</p><p>　　此次實(shí)驗(yàn)是在西華大學(xué)生物工程古法發(fā)酵生物技術(shù)研究所內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)室給我的第一印象是學(xué)風(fēng)嚴(yán)謹(jǐn)，這次試驗(yàn)的全過程中我也一直感受

75、著這個(gè)優(yōu)良的作風(fēng)。實(shí)驗(yàn)室的老師和師兄對待科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)和鉆研精神讓我受益非淺，我將以后在的學(xué)習(xí)和生活中都本著嚴(yán)謹(jǐn)刻苦的精神進(jìn)行。</p><p><b>　　致謝詞</b></p><p>　　本論文能順利的完成，是在向文良老師的指導(dǎo)下對四年大學(xué)學(xué)習(xí)的一個(gè)總結(jié)。在近兩個(gè)月的實(shí)驗(yàn)中，老師既是良師又是益友，我自始自終得到了向老師的指導(dǎo)和幫助。從實(shí)驗(yàn)方案的確定到理論問題的討論，

76、每遇困難時(shí)，總是能得到向老師的悉心指點(diǎn)。他們嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)風(fēng)和謙和的為人使我受益非淺；他們還在百忙之中，花費(fèi)了不少寶貴的時(shí)間來為我修改論文，使之盡可能完善和嚴(yán)謹(jǐn)，正是在向老師熱心的幫助和指導(dǎo)下，我順利的完成了畢業(yè)論文。在此衷心的感謝向文良老師對我的幫助。同時(shí)，我也要感謝在我實(shí)驗(yàn)過程中一直與我們在一起的師兄師姐，感謝他們對我的細(xì)心指導(dǎo)、幫助和關(guān)心，他們實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度、勇于探索的創(chuàng)新意識、嚴(yán)謹(jǐn)務(wù)實(shí)的治學(xué)作風(fēng)是我以后學(xué)習(xí)的楷模！此外，我還要感謝

77、生物工程實(shí)驗(yàn)中心全體老師為我們提供開展實(shí)驗(yàn)的空間和各種實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器；最后，我要感謝生物工程學(xué)院所有老師這四年對我的教導(dǎo)，感謝全體同學(xué)和朋友們對我各方面的關(guān)心和支持，謝謝大家！</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 劉賢嫻. 蘿卜營養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)積累規(guī)律研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.</p><p

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