豬GDF11多克隆抗體的制備、前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、本文分為兩個(gè)研究方向：豬GDF11蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化及其多克隆抗體的制備與檢測(cè)和豬前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化。 第一部分：原核表達(dá)蛋白的純化及多克隆抗體制備及檢測(cè) 生長分化因子11(GDF11)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族、Myostatin/GDF11亞家族的一種分泌蛋白。GDF11的表達(dá)水平可能與豬的胸腰椎數(shù)的多少有關(guān)。為了分析GDF11在不同胸腰椎數(shù)的豬品種中的表達(dá)差異，獲得該蛋白的抗體十分必要。

2、 將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-GDF11經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切，將回收的GDF11酶切片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-2中，獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-GDF11。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并經(jīng)異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)產(chǎn)生了65KDa的GST-GDF11融合蛋白。融合蛋白以包涵體的形式存在，經(jīng)稀釋復(fù)性和凝血酶酶切，分離純化出42 KDa左右

3、的GDF11蛋白，SDS-PAGE分離純化出GDF11蛋白。 純化的GDF11蛋白注射小鼠，取其血清獲得抗GDF11蛋白的多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)其滴度最高可達(dá)1：25600。經(jīng)Western印跡的結(jié)果表明，制備的多克隆抗體對(duì)LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)GDF11蛋白具有較高的特異性，是進(jìn)一步研究GDF11表達(dá)調(diào)控機(jī)制和功能的基礎(chǔ)。 第二部分：豬前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 脂肪沉積性狀是豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀，與豬肉

4、品質(zhì)及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值緊密聯(lián)系。萊蕪豬的肌間脂肪含量比其他品種都要高，研究其脂肪沉積有重要的意義。脂肪細(xì)胞在體外很難培養(yǎng)；而脂肪組織中的前脂肪細(xì)胞在體外可以培養(yǎng)，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。 本研究從三日齡萊蕪豬的背部皮下獲得皮下脂肪，經(jīng)膠原酶消化，分離培養(yǎng)了萊蕪豬的前體脂肪細(xì)胞。前體脂肪細(xì)胞融合后的第二天，用胰島素和地塞米松誘導(dǎo)分化，經(jīng)誘導(dǎo)分化獲得成熟脂肪細(xì)胞。在顯微鏡下觀察細(xì)胞分化前后的形態(tài)，前體脂肪細(xì)胞呈纖維樣；成熟的脂肪