耳聾基因檢測與耳聾一級預防final

1、柴 永 川蘇州大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科,耳聾基因檢測與一級預防,耳聾防治 是重大醫(yī)學難題,全球聽力障礙人數(WHO),N Engl J Med. 2007,,耳聾基礎,——數據來自：第二次（2006年）全國殘疾人抽樣調查,中國耳聾人群龐大,,耳聾基礎,先天性聽力障礙發(fā)病率： 1-3‰ 全國每年新增耳聾患兒： 2-6萬,先天性聽力障礙－發(fā)病率高,每10000新生兒中先天性出生缺陷的發(fā)生率,,耳聾基礎,導致嚴重后果：語言障礙（

2、十聾九?。┠壳盁o有效治療方法，主要依賴助聽器與人工耳蝸植入等輔助手段影響終生：家庭社會負擔沉重每個聽障患兒增加社會成本約20-50萬元,先天性聽力障礙－危害性高,,耳聾基礎,效果依賴早期發(fā)現、早期診治和防控,助聽器驗配,人工耳蝸植入,先天性聽力障礙－高度可干預性,言語康復訓練,,耳聾基礎,先天性耳聾防治思路,,,,東部地區(qū),中部地區(qū),西部地區(qū),UNHS及干預網絡的建立與實施,聾病基因孕前產前篩查降低出生率,,,,高危因素篩查及

3、干預模式的建立與實施,,,關口前移,重心下移,重心下移,,,偏遠地區(qū),,重心下移,,兒童保健網絡篩查及干預,,耳聾基礎,耳聾的病因復雜：遺傳性病因占主要部分,明確的遺傳因素為耳聾的預防創(chuàng)造條件,,耳聾基礎,非綜合征性耳聾基因>60個顯性 30個隱性 50個線粒體 2個X-連鎖 4個綜合征性耳聾基因>40個,遺傳性耳聾具高度遺傳異質性,——Hereditary hearing loss Homepag

4、e,,耳聾基礎,常見耳聾基因少，占遺傳因素多,《Journal of translational medicine》:GJB2 mutation spectrum in 2063 Chinese patients with non-syndromic hearing impairment,《American journal of medical genetics》:Molecular etiology of hearing impair

5、ment associated with non-syndromic enlarged vestibular aqueduct in East China.,《 American journal of human genetics 》:Maternally inherited aminoglycoside-induced and nonsyndromic deafness is associated with the novel C14

6、94T mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family.,針對常見耳聾基因的一級預防具有高度可行性,常見耳聾基因占遺傳性耳聾50%以上，藥物性耳聾40%以上GJB2 （～40%-50%）SLC26A4 （～15%-20%）線粒體基因 （40%以上藥物性耳聾）,,常見耳聾基因檢測,,,基因檢測與婚育指導,產前診斷,常見耳聾基因篩查,,,,,常

7、見耳聾基因檢測,聾病基因篩查在北京、上海等重點城市已得到初步開展，篩查技術成熟GJB2SLC26A4線粒體DNA突變熱點,,常見耳聾基因篩查,常見聾病基因篩查使先天性聽力障礙的預防成為可能,,常見耳聾基因檢測,耳聾基因篩查與預防模式,高危篩查模式目標：高危人群（耳聾人群及其親屬等）篩查手段：全序列測定為主（GJB2、SLC26A4和MT-RNR1）篩查時間：孕前、婚前、戀前普遍篩查模式目標：正常聽力人群篩查手段：快速篩

8、查為主，序列測定為輔(GJB2、SLC26A4和MT-RNR1三大基因的熱點突變)篩查時間：孕前或孕早期,,常見耳聾基因檢測,耳聾基因高危篩查,試點及合作單位：上海市長寧區(qū)殘聯會員,,常見耳聾基因檢測,GJB2雙等位基因突變（29.5%）,SLC26A4雙等位基因突變（14.1%）,線粒體基因突變（6.0%）,原因不明：（50.3%),,,,,常見耳聾基因突變檢出比例：49.7%,耳聾基因高危篩查,N>200例,,常見耳聾基因檢

9、測,耳聾基因高危篩查,優(yōu)缺點分析,,常見耳聾基因檢測,耳聾基因普遍篩查,,育齡或孕早期女性,,隱性基因突變攜帶者,,配偶基因芯片篩查,,耳聾基因芯片篩查,,夫婦雙方均為同證基因突變攜帶者,,線粒體A1555G突變,,產前基因診斷,,遺傳咨詢,,藥物性耳聾遺傳咨詢,,,,,,,,,,常見耳聾基因檢測,有效檢測樣本（懷孕早期孕婦）：3056例孕婦中攜帶耳聾基因突變160例，占總樣本的5.23%。攜帶者自身均聽力正常，157例無家族史，3

10、例MT突變孕婦家族多人有藥物性聾病史。MT突變7例，對母系成員進行氨基糖苷類抗生素藥物預警，以避免藥物性耳聾全序列檢測非MT突變的陽性孕婦配偶124例，13家庭具隱性遺傳性耳聾生育風險， 5例進行了產前診斷，1例胎兒為p.V37I/c.235delC復合雜合，其余為突變攜帶或野生型。,耳聾基因普遍篩查,,常見耳聾基因檢測,耳聾基因普遍篩查,優(yōu)缺點分析,,常見耳聾基因檢測,耳聾基因診斷與遺傳咨詢實例,產前基因診斷可有效預防隱性遺傳性耳

11、聾的再生育風險,,耳聾遺傳咨詢,,,,,,父母耳聾，孩子個個耳聾,同證婚配：后代100%會耳聾,耳聾基因診斷與遺傳咨詢實例,聾人婚前進行耳聾基因檢查，可避免同證婚配的出現,,,,,,,耳聾遺傳咨詢,,,,,AA;bb aa;BB,?,攜帶不同隱性耳聾基因突變的聾人夫婦可生育正常聽力的孩子,耳聾基因診斷與遺傳咨詢實例,,耳聾遺傳咨詢,,Bb,耳聾基因診斷可為遺傳性耳聾高危人群提供生育風險評估及預防,,耳聾基因診斷與遺傳咨詢

12、實例,,耳聾遺傳咨詢,,,,,C,?,攜帶線粒體耳聾基因突變的人群通過指導可避免藥物性耳聾的發(fā)生,耳聾基因診斷與遺傳咨詢實例,,耳聾遺傳咨詢,耳聾基因遺傳咨詢與診斷,了解病因，幫助確診 預防下一代聾病的發(fā)生 預防親屬或下一代藥物性耳聾的可能,,耳聾遺傳咨詢,罕見已知耳聾基因檢測,非常見耳聾基因致病患者的分子病因 罕見已知耳聾基因致病？ 罕見已知耳聾基因眾多，如何檢測？,,罕見耳聾基因檢測,本研究所檢測的79個耳聾基因,常見的

13、耳聾致病基因：Sanger測序,罕見耳聾基因檢測：定向捕獲二代測序可行性分析：OtoSCOPE®芯片（54個已知耳聾基因，2010年，University of Iowa）79個已知耳聾基因的二代測序（本研究）,2010年二代測序首次應用于已知耳聾基因檢測,適宜的檢測技術,罕見已知耳聾基因檢測,,罕見耳聾基因檢測,,總樣本量：183例,經濟高效的檢測方案,檢測方案（二步法）第一步：常見耳聾基因Sanger測序（所有樣本）

14、第二步：79個耳聾基因二代測序（排除常見耳聾基因致病樣本）,二步法優(yōu)點：節(jié)約二代測序樣本數量,罕見已知耳聾基因檢測,,罕見耳聾基因檢測,79個已知耳聾基因病因構成圖,常見耳聾基因突變：35.5%GJB2: 19.7%SLC26A4：12.0%MT-RNR1: 3.8%罕見耳聾基因突變：15.8%,罕見已知耳聾基因病因構成：15.8%,罕見已知耳聾基因檢測,,罕見耳聾基因檢測,罕見耳聾基因的異質性強,罕見基因突變分布圖,致病突

15、變廣泛分布于15個基因中,新發(fā)突變占絕大多數,致病突變是否報道分布圖,Orphanet Journal of Rare Diseases 2013, 8:85,罕見已知耳聾基因檢測,,罕見耳聾基因檢測,新耳聾基因克隆與發(fā)現,所有已知耳聾基因檢測后都為陰性 新耳聾基因致病？已知耳聾基因非編碼區(qū)致病？已知耳聾基因大片段缺失？……,,新耳聾基因克隆,,遺傳性耳聾家系連鎖分析,遺傳標記,基因型分離,表型分離,基因型-

16、表型共分離,耳聾基因的定位克隆,,新耳聾基因克隆,外顯子捕獲/二代測序,二代測序,耳聾基因定向外顯子捕獲/測序平臺排除已知耳聾基因增加克隆新耳聾基因的把握,,,,新耳聾基因克隆,Genome-Wide Linkage Analysis,Performed in 9 affected and 9 unaffected (>35 yrs),,,,,,,,,,,,,,,,,,,新耳聾基因克隆,候選區(qū)域,,,,,,,,,,新耳聾基

17、因克隆,Genome-Wide Linkage Analysis,9 affected and 8 unaffected Illumina OmniZhongHua BeadChip (900,015 SNPs) Chr16p13 kgp1005458-kgp2546988 (2.1 Mb) Maxium LOD = 3.8 Overlapped with DFNB86 interval,,新耳聾基因克隆,Whole Exo

18、me Sequencing,3 affected and 2 unaffected,,,,,,,新耳聾基因克隆,Whole Exome Sequencing,Candidate variants: non-synonymous variants (missense, nonsense, splicing site, indels, etc) with allele frequencies ≤ 0.001,,II-3,III-9,III-

19、7,III-5,III-11,II-3, III-7, III-9: Affected III-5, III-11: Unaffected,,新耳聾基因克隆,Whole Exome Sequencing,Confirmed by Sanger sequencing in all family members,,,新耳聾基因克隆,Genome-Wide Linkage Analysis,9 affec

20、ted and 8 unaffected Illumina OmniZhongHua BeadChip (900,015 SNPs) Chr16p13 kgp1005458-kgp2546988 (2.1 Mb, 124 genes) Maxium LOD = 3.8 Overlapped with DFNB86 interval,,,,新耳聾基因克隆,The p.Ser178Leu Variant of TBC1D24,H

21、ighly conservative Not seen in 1000 normal hearing controls,,新耳聾基因克隆,Hum Mutat，2014, 35(7):814-818,TBC1D24,,新耳聾基因克隆,耳聾基因檢測技術：一代測序,DNA抽提 > PCR擴增 > 擴增片段測序 > 突變檢測優(yōu)點：可覆蓋目標基因全部編碼序列，適合特定目標診斷,,總結-檢測技術,高通量定點突變檢測技術,耳聾