自噬研究資料

1、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)研究,細(xì)胞大掃除-自噬作用 (Autophagy),2008-04-23,2,,細(xì)胞死亡是生命現(xiàn)象不可逆停止及生命的結(jié)束，正常的組織中經(jīng)常發(fā)生細(xì)胞死亡，是維持組織機能和形態(tài)所必須的。細(xì)胞死亡的方式通常有2種：被動死亡：細(xì)胞壞死（necrosis）主動死亡：細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）,2008-04-23,3,細(xì)胞壞死（necrosis）,概念：細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到強烈理化或生物因素作

2、用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。主要形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞發(fā)生腫脹，最后導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和溶解，細(xì)胞內(nèi)前炎癥因子等內(nèi)容物釋放，引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞壞死現(xiàn)象與人類多種疾病相關(guān)。病原體感染：如病毒感染引起的急性重型肝細(xì)胞壞死炎 癥 性 疾 ?。杭?性 胰腺 炎 、 缺 血性 傷 害 、 神 經(jīng) 退 化、腸道 和皮 膚 炎 癥 性 疾 病等。例如

3、青光眼導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死，造成視力逐漸減弱，最終導(dǎo)致失明。,檢測方法,電鏡觀察檢測細(xì)胞活力程序性細(xì)胞壞死信號通路檢測,,,2008-04-23,6,程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD),與細(xì)胞壞死不同，程序性細(xì)胞死亡是受基因控制的另一種細(xì)胞死亡方式，是生物體在漫長進(jìn)化過程中逐步建立起來的“自殺機制”。即細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循特定的程序，結(jié)束自身生命的過程。誘發(fā)因素：包括體外因素，如射線、藥

4、物和病毒感染等；體內(nèi)因素，如腫瘤、自身免疫病和退行性病變等。典型形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞膜完整、無前炎癥因子等細(xì)胞內(nèi)容物流出，無炎癥反應(yīng)。程序性細(xì)胞死亡是機體穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境和平衡細(xì)胞數(shù)量的重要調(diào)節(jié)機理。,2008-04-23,7,程序性細(xì)胞死亡的分類類型,（一）基于機制的程序性細(xì)胞死亡分類：1. 細(xì)胞凋亡（apoptosis）2. 自噬性細(xì)胞死亡（autophagic cell death）3. 類凋亡（paraptosis）4. 有絲分

5、裂災(zāi)難（mitotic catastrophe）5. 脹亡（oncosis）（二）基于形態(tài)的程序性細(xì)胞死亡分類1. 基于細(xì)胞核改變的分類2. clarke分類（三）形態(tài)學(xué)分類與機制分類的關(guān)系,2008-04-23,8,基于細(xì)胞核改變的分類,細(xì)胞核在細(xì)胞死亡時變化比較明顯，所以很多人以此為標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞死亡分為凋亡、凋亡樣程序性細(xì)胞死亡、壞死樣程序性細(xì)胞死亡和壞死，其中前三種是程序性細(xì)胞死亡，壞死是非程序性細(xì)胞死亡。,2008-04

6、-23,9,凋亡細(xì)胞核的特點：染色質(zhì)凝聚，成球狀或半月狀。還有磷脂酰絲氨酸外翻、細(xì)胞皺縮、凋亡小體形成等。凋亡一般都會伴有Caspase尤其是Caspase3的活化。 凋亡樣程序性細(xì)胞死亡核的特征：染色質(zhì)凝聚的程度較低，比凋亡細(xì)胞的染色體疏松一些，同時可以有凋亡細(xì)胞其它方面的形態(tài)學(xué)的變化，多數(shù)文獻(xiàn)中描述的Caspase非依賴的凋亡歸于此類。壞死樣程序性細(xì)胞死亡一般無染色質(zhì)的凝聚或者只有疏松的點狀分布，一些特殊的Caspase非依賴的

7、死亡歸于此類。,2008-04-23,10,,線粒體在細(xì)胞死亡中扮演著核心角色，其所釋放的促進(jìn)細(xì)胞死亡的分子大致有三類。第一類是細(xì)胞色素C，它與胞漿里的Apaf-1，ATP和Caspase-9前體分子形成Apoptosome，引起Caspase-9的激活，進(jìn)而激活Caspase-3，引起典型的凋亡。第二類是超氧自由基，可以使細(xì)胞發(fā)生壞死樣程序性細(xì)胞死亡，且此效應(yīng)可以被抗氧化劑所拮抗。第三類是AIF，AIF可以切割染色體產(chǎn)生大的DN

8、A片段（約50kB），使細(xì)胞發(fā)生凋亡樣程序性細(xì)胞死亡。,2008-04-23,11,Clarke分類,1990年Clarke等補充了Schweichel和Merker對于細(xì)胞死亡的分類，將程序性細(xì)胞死亡分為I類、II類和III類，至今仍被廣泛應(yīng)用。I類程序性細(xì)胞死亡即是凋亡，這類死亡一般沒有溶酶體的參與，且死后會被吞噬細(xì)胞所吞噬。II類程序性細(xì)胞死亡即是自吞噬性程序性死亡，其主要的形態(tài)學(xué)特征是自吞噬泡的形成，自吞噬泡和溶酶體融合后被

9、消化，細(xì)胞殘骸被吞噬細(xì)胞吞噬。III類程序性細(xì)胞死亡即是壞死樣程序性細(xì)胞死亡，其主要的形態(tài)學(xué)特征是各種細(xì)胞器的腫脹、胞膜的破壞等，這類細(xì)胞死亡沒有溶酶體的參與，細(xì)胞器的腫脹表現(xiàn)比較明顯，而且死亡后會被吞噬細(xì)胞吞噬。,2008-04-23,12,形態(tài)學(xué)分類與機制分類的關(guān)系,2008-04-23,13,細(xì)胞凋亡（apoptosis）,細(xì)胞凋亡一詞最早是由英國的病理學(xué)家科爾和希臘語教授馬克于1972年提出的。在希臘語中，apo的意思是脫離，

10、ptosis的意思為落下，將這兩個詞組合（apoptosis）用來描述與秋葉落下和花兒凋謝類似的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。到1990年代，細(xì)胞凋亡的研究獲得了里程碑式的重大進(jìn)展，證明細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的主動過程，典型的細(xì)胞凋亡過程涉及一系列半胱天冬酶（caspase）的水解、活化和信號傳遞過程。,2008-04-23,14,細(xì)胞凋亡的生理意義,細(xì)胞凋亡的生理意義：細(xì)胞凋亡對于保證個體正常發(fā)育、維持正常生理功能，并使機體適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化具有重要的

11、生理意義。,2008-04-23,15,細(xì)胞凋亡的生理意義,細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、組織分化和修復(fù)等過程有緊密的聯(lián)系。為適應(yīng)發(fā)育或組織更新的需要，機體中的細(xì)胞會在某些特定的時刻發(fā)生凋亡。例如：在皮膚外層細(xì)胞的形成過程中，皮膚細(xì)胞生成于皮膚深層，然后慢慢向外表面遷移，遷移途中有些會發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞就會形成具有保護(hù)作用的皮膚角質(zhì)層。又如，人的唯一透明組織——眼球晶狀體的發(fā)育，在胎兒形成早期階段，由干細(xì)胞發(fā)育來的晶狀體細(xì)胞與其他所

12、有細(xì)胞一樣都含有細(xì)胞器，但隨著發(fā)育和分化的進(jìn)展，晶狀體細(xì)胞發(fā)生特殊形式的凋亡，胞質(zhì)中的細(xì)胞核和細(xì)胞器被毀壞，只保留完整的細(xì)胞膜，細(xì)胞膜內(nèi)包裹著極濃稠的“晶狀體蛋白質(zhì)”溶液，成為成熟的晶狀體。,2008-04-23,16,細(xì)胞凋亡的生理意義,此外，在成年階段，細(xì)胞凋亡也是機體清除體內(nèi)多余的、受損的、癌變的或被微生物感染的細(xì)胞的重要手段。如T淋巴細(xì)胞在胸腺成熟過程中，約有95% 以上不成熟的細(xì)胞發(fā)生凋亡，只有不到5%的細(xì)胞分化為成熟的T

13、淋巴細(xì)胞進(jìn)入外周血，并發(fā)揮其免疫學(xué)功能。,2008-04-23,17,細(xì)胞凋亡的病理意義,細(xì)胞凋亡的病理意義：細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失控或錯誤將會引起生物體的發(fā)育異常、功能紊亂和嚴(yán)重疾病。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的疾病如濾泡性淋巴瘤、乳腺癌和白血病等惡性腫瘤，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎炎等自身免疫性疾病，腺病毒和皰疹病毒感染的疾病等，均與細(xì)胞凋亡缺陷（“該死不死”）有關(guān)；而阿爾茨海默病、帕金森氏病和小腦退化癥等神經(jīng)退行性疾病、骨髓發(fā)育不全性疾病、缺血性損傷和酒精

14、中毒性肝炎等則與細(xì)胞凋亡過度（“不該死的死了”）有關(guān)。,Caspase活性檢測,細(xì)胞凋亡早期階段的顯著特征是caspase酶的活化，其參與了蛋白底物剪切以及隨后的細(xì)胞裂解。流式細(xì)胞術(shù)：Caspase-3/7 PARP蛋白水解：凋亡過程中，ICE家族成員如caspase-3和-7可分解PARP，產(chǎn)生85 kDa和25 kDa的片段。 PARP剪切被認(rèn)為是凋亡過程的典型特征之一。 FITC偶聯(lián)的抗PARP抗體特異性識別PAR

15、P水解的85 kDa片段，其可用作檢測凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物。,流式細(xì)胞術(shù)線粒體凋亡分析,細(xì)胞凋亡早期階段的顯著特征是線粒體的破裂，包括膜電位和氧化-還原電位的改變。線粒體膜電位分析線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔分析,DNA片段和形態(tài)學(xué)研究,細(xì)胞凋亡晚期以細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化為特征，包括DNA片段化、染色質(zhì)凝聚、核膜降解、細(xì)胞核起泡以及DNA鏈斷裂。流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞核凋亡分析 用Vybrant® DyeCycle? Violet染料

16、及SYTOX® AADvanced?染料進(jìn)行染色質(zhì)凝聚分析DNA片段化 (TUNEL分析),Annexin V染色,Annexin V染色用于檢測細(xì)胞凋亡中期。,流式細(xì)胞術(shù)凋亡細(xì)胞質(zhì)膜分析方法,一些可檢測的最早的凋亡事件與質(zhì)膜有關(guān)，包括不對稱性和通透性的改變。 除膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物外，Life Technologies還可提供獨特的分析方法，檢測在膜聯(lián)蛋白V結(jié)合較為困難的情況下質(zhì)膜的變化，例如貼壁細(xì)胞以及未使用特殊的緩沖液時。

17、膜聯(lián)蛋白結(jié)合物在凋亡細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸 (PS) 從質(zhì)膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。 熒光基團(tuán)或生物素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V可與暴露在質(zhì)膜外側(cè)的PS結(jié)合，用于識別凋亡細(xì)胞。紫色不對稱性探針單體花青染料,凋亡相關(guān)通路研究,BCL-2 Family-regulated pathway Death-receptor-regulated pathway TNF Receptor pathwayFas signalling pa

18、thway (CD95) Caspase family NF-kß signalling pathway p53 activation IAP family IAP inhibitor CARD family Kinases,2008-04-23,24,,盡管細(xì)胞凋亡是了解最多的一種程序性細(xì)胞死亡過程，但是近期研究認(rèn)為自我吞噬作用是一種高度調(diào)節(jié)、異化過程，能使細(xì)胞自己吃掉自己。有趣的是，自我吞噬還能為細(xì)胞提供在不

19、能進(jìn)行凋亡時的一種替代形式的自我毀滅。,2008-04-23,25,自噬性細(xì)胞死亡（ autophagic cell death ）,概述：自噬性細(xì)胞死亡的現(xiàn)象早在20世紀(jì)60年代就已發(fā)現(xiàn)，它是指細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解自身細(xì)胞器和其他大分子的過程。細(xì)胞自噬首先是將胞質(zhì)內(nèi)含物（包括蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等）進(jìn)行隔離和運輸，然后通過溶酶體進(jìn)行水解酶消化降解的過程。細(xì)胞自噬對細(xì)胞正常行使功能是至關(guān)重要的，而自噬功能喪失是細(xì)胞損傷累積和細(xì)胞老化的主要起因。

20、形態(tài)學(xué)特征：電鏡下可觀察到胞質(zhì)中有大量包裹著細(xì)胞漿和細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)，稱作自噬泡，胞質(zhì)濃縮，質(zhì)膜通透性改變。主要過程：自噬泡與溶酶體發(fā)生融合，自噬泡所包裹著的待降解物質(zhì)進(jìn)入溶酶體，在各種酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等，并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生小分子和能量（ATP），再被細(xì)胞所利用。,2008-04-23,26,自噬的過程,自噬途徑（包含p62及LC3B）示意圖.其第一步為隔離膜（又叫吞噬泡）的形成和延伸；第二步則指吞噬泡發(fā)生擴展和細(xì)

21、胞質(zhì)隔離，從而形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，在此步驟中LC3蛋白會吸附到自噬體上，而p62則與泛素蛋白結(jié)合后再結(jié)合到LC3B蛋白上；之后溶酶體與自噬體發(fā)生融合而形成自噬性溶酶體，這一步中LC3B會與自溶酶體分離，而p62和與其結(jié)合的泛素蛋白則會發(fā)生降解。,2008-04-23,27,自噬性細(xì)胞死亡（ autophagic cell death ）,長期以來細(xì)胞自噬被認(rèn)為是細(xì)胞的自救行為，溶酶體參與其中的全過程。但近年發(fā)現(xiàn)，在某些條件下，細(xì)

22、胞自噬也能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并證明自噬的發(fā)生受多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，如ATG（autophagy）基因、蛋白激酶基因和磷酸酶基因等。迄今至少已鑒定了30種參與酵母自噬的特異性基因，統(tǒng)一命名為酵母自噬相關(guān)基因Atg (autophagy-related genes)。在哺乳動物中也分離鑒定到許多自噬相關(guān)基因，大多與酵母自噬相關(guān)基因高度同源，表明細(xì)胞自噬在進(jìn)化上是高度保守的。,2008-04-23,28,自噬性細(xì)胞死亡（ autophagic

23、cell death ）,哺乳動物細(xì)胞中由Atg5-Atg12-Atg16L組成的復(fù)合物是形成自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)所必需的，LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例與自噬泡形成的數(shù)量呈正相關(guān)。Beclin Ⅰ-Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸酶（Class Ⅲ PI3K）復(fù)合物和Sec基因（Sec12、Sec16、Sec23/24）參與自噬體的形成。與此相反，氨基酸、ATP和激素的感受器TOR激酶和G蛋白亞基Gai3是細(xì)胞自噬活動的負(fù)調(diào)控因子。,

24、2008-04-23,29,自噬性細(xì)胞死亡的意義,自噬也是細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境或滿足自身發(fā)育需要的一種調(diào)節(jié)方式。細(xì)胞自噬與疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。在心肌和骨骼肌中，過度自噬會導(dǎo)致α-葡糖苷酶缺失，引起糖原分解障礙，使糖原發(fā)生堆積，導(dǎo)致Ⅱ型糖元貯積病的發(fā)生。在神經(jīng)細(xì)胞中變性蛋白的過度堆積是帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的主要病理特征?；疾≡缙?，被激活的細(xì)胞自噬行為能清除這些變性蛋白，但隨著病情的發(fā)展，當(dāng)變性蛋白的積累

25、速率超過自噬的清除能力，就會引起自噬的過度激活，發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，加重病情發(fā)展。,2008-04-23,30,自噬性細(xì)胞死亡的意義,在機體受到脊髓灰質(zhì)炎病毒和SARS冠狀病毒等病原體感染時，細(xì)胞自噬具有雙重作用。一方面，細(xì)胞自噬能將進(jìn)入胞內(nèi)的病原體，通過降解作用加以清除，保護(hù)正常細(xì)胞不被感染；另一方面，細(xì)胞自噬形成的自噬泡雙層膜結(jié)構(gòu)成為病毒或細(xì)菌的“避難所”，使其逃避宿主的清除作用。因此，細(xì)胞自噬對人類健康是一把雙刃劍。,,異常的

26、細(xì)胞自噬現(xiàn)象與多種重要疾病有關(guān)，例如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、免疫性疾病等。因此，能夠補救這種缺陷的小分子在臨床治療中被認(rèn)為大有前景。研究細(xì)胞自噬中自噬體形成和自噬過程的各方面，及通過高通量技術(shù)觀察小分子和基因操作在其生理相關(guān)的細(xì)胞模型中的影響，這一類工作在研究中非常重要，不僅有助于理解細(xì)胞自噬過程，更可為采取有效的治療措施提供極大的幫助。,2008-04-23,32,,人們對細(xì)胞凋亡和自噬的認(rèn)識主要從細(xì)胞形態(tài)、理化性質(zhì)、調(diào)節(jié)基因和病理表現(xiàn)

27、等方面加以辨認(rèn)。隨著對細(xì)胞自噬現(xiàn)象和機制的漸深了解，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與凋亡之間似乎存在著某種調(diào)控機制，可調(diào)節(jié)二者的相互拮抗或促進(jìn)或相互替換（substitute）。,2008-04-23,33,,例如，自噬相關(guān)調(diào)控基因Beclin Ⅰ/Atg6能上調(diào)caspase-9的活性，增強化療藥物CDDP誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞MKN28的凋亡；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)封閉Atg基因（Atg5、Atg6/BeclinⅠ、Atg10、Atg12）或者使用auto

28、phagy特異抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）處理，細(xì)胞在營養(yǎng)被剝奪的情況下，發(fā)生凋亡型的程序性細(xì)胞死亡；Caspase廣譜抑制劑Z-VAD能通過抑制caspase-8的活性，誘導(dǎo)Atg7和BeclinⅠ基因參與的自噬性細(xì)胞死亡。,使用LC3B和p62來追蹤自噬過程,LC3B可從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中獲得，并與早期自噬過程中的吞噬泡形成有關(guān)。這種定位信息可作為自噬膜的常用標(biāo)記，還可監(jiān)控其發(fā)展變化的過程。p62可作

29、為將要被自噬作用降解的小泡的受體，也可作為要被清除的泛素化蛋白聚集物的受體。p62蛋白可結(jié)合泛素，也可與LC3結(jié)合，從而靶向自噬體并促進(jìn)泛素化蛋白的清除。,溶酶體標(biāo)記,溶酶體與隔離細(xì)胞膜融合從而形成自噬性溶酶體是自噬途徑的倒數(shù)第二步。溶酶體膜標(biāo)記可作為在自噬性溶酶體內(nèi)含物降解前追蹤自噬性溶酶體融合的有效工具。溶酶體內(nèi)含物標(biāo)記,蛋白質(zhì)合成及降解,新生蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾過程,,AKT/mTOR Pathway ProductsIn

30、tracellular ProteinsExtracellular Growth Factors/CytokinesReceptor Tyrosine Kinases,2008-04-23,38,類凋亡（paraptosis）,詞根para-為“接近，相似”之意。2000年Sperandio等在293T細(xì)胞系中超表達(dá)胰島素樣生長因子1受體（IGFIR）時發(fā)現(xiàn)一種與經(jīng)典凋亡不同的死亡表型，并定義為Paraptosis。形態(tài)學(xué)特征：

31、細(xì)胞漿空泡化，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，但沒有核固縮現(xiàn)象。 目前，paraptosis的研究主要集中在形態(tài)學(xué)上，與細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的形態(tài)表現(xiàn)不同，區(qū)別見下表。,2008-04-23,39,Paraptosis與細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡的形態(tài)差異,2008-04-23,40,,現(xiàn)在Paraptosis的文獻(xiàn)報道比較少，其機制有待于進(jìn)一步深入研究。高劑量的IGF或胰島素等營養(yǎng)因子可以通過IGFIR活化MAPK/ERK以及JNK通路引起Parapto

32、sis的發(fā)生，并且可以被AIP1/Alix特異性地抑制。,2008-04-23,41,Paraptosis細(xì)胞的檢測,下面介紹四種常用的檢測方法：1)瓊脂糖凝膠電泳觀察染色質(zhì)DNA被核糖內(nèi)切酶降解產(chǎn)生的“階梯狀DNA區(qū)帶”：paraptosis細(xì)胞為陰性。2)ISEL(DNA原位缺口轉(zhuǎn)移)，TUNEL(DNA原位末端標(biāo)記法)：paraptosis細(xì)胞為陰性。3)凋亡抑制劑檢測：caspase蛋白酶抑制劑(如：z-VAD．fmk，B

33、AF，p35)和Bcl家族(如：Bcl-XL)都不能抑制paraptosis細(xì)胞死亡。4)細(xì)胞凋亡的酶學(xué)分析：caspase-3、PARP片段分析為陰性。通過以上方法可進(jìn)一步證明paraptosis是與凋亡不同的另外一種程序性細(xì)胞死亡方式。,2008-04-23,42,Paraptosis過程中的生化機制,1）Paraptosis需要轉(zhuǎn)錄和翻譯 放線菌素D和放線菌酮能阻斷paraptosis產(chǎn)生，證明paraptosis過程

34、中有活躍的RNA及蛋白質(zhì)合成。而在細(xì)胞凋亡中，有無轉(zhuǎn)錄和翻譯則取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞凋亡的刺激物。在壞死的細(xì)胞中則完全沒有RNA和蛋白質(zhì)的合成。,2008-04-23,43,,2）調(diào)控paraptosis的信號途徑 CD47可作為淋巴細(xì)胞上的死亡受體，激活non-classical form of apoptosis，不依賴于caspase介導(dǎo)細(xì)胞死亡。3）Paraptosis的產(chǎn)生需要Caspase-9 此反應(yīng)是ca

35、spase-9特異性的，但這種細(xì)胞死亡方式不具備線粒體依賴的細(xì)胞凋亡路徑，即沒有細(xì)胞色素C的釋放和凋亡小體的形。,2008-04-23,44,,4）Paraptosis與細(xì)胞色素C Margaret用糖皮質(zhì)激素在過氧化氫酶或硫氧還蛋白過度表達(dá)的胸腺細(xì)胞中誘導(dǎo)出paraptosis，該細(xì)胞的線粒體不向胞漿中釋放或延遲釋放Cyt C。5）與paraptosis相關(guān)的基因 可能與bcl-2基因和p53基因無關(guān)。,2008

36、-04-23,45,Paraptosis的病理生理意義,1.與神經(jīng)變性和何杰金氏淋巴瘤有關(guān)。2. 與細(xì)胞分化、生物體發(fā)育有關(guān)。,2008-04-23,46,細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難（mitiotic catastrophe）,1989年，Lisa Molz等發(fā)現(xiàn)在酵母的一種對熱敏感的突變株中，細(xì)胞分裂時染色體分離發(fā)生異常。相應(yīng)的一些學(xué)者便把這種在DNA發(fā)生損害時，細(xì)胞無法進(jìn)行完全的分裂從而導(dǎo)致四倍體或多倍體的現(xiàn)象稱為細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難。,200

37、8-04-23,47,,形態(tài)學(xué)特征：主要是巨細(xì)胞的形成，內(nèi)有多個小核，染色質(zhì)凝聚。 DNA發(fā)生損害時，如果細(xì)胞不能有效地阻斷其細(xì)胞周期的進(jìn)行，會導(dǎo)致染色體的異常分離，這些非正常分裂的細(xì)胞在下一輪有絲分裂中會繼續(xù)導(dǎo)致細(xì)胞多倍體的形成從而成為癌變的基礎(chǔ)。而細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難作為一種死亡機制可以使這種非正常分裂的細(xì)胞死亡。細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難由多種分子調(diào)控，如CDK1，P53及Survivin等，其死亡信號傳遞有很大一部分與凋亡相重疊。,2008-

38、04-23,48,脹亡（ oncosis ）,1910年，von Reckling-hausen在骨軟化病中發(fā)現(xiàn)由于缺血而腫脹壞死的骨細(xì)胞，他把這種腫脹壞死叫做Oncosis。1995年Majno和Joris為與凋亡相區(qū)別，重新引入了Oncosis的概念，把具有明顯腫脹特點的細(xì)胞死亡命名為Oncosis，中文一般翻譯為脹亡。脹亡的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞腫脹，體積增大，胞漿空泡化，腫脹波及細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，胞膜起泡，細(xì)胞膜完整

39、性破壞。脹亡細(xì)胞周圍有明顯炎癥反應(yīng)。,2008-04-23,49,,對于脹亡發(fā)生的機制現(xiàn)有的文獻(xiàn)闡述較少，有研究者認(rèn)為脹亡只是壞死前的一個被動性死亡階段。但是近年來的研究更傾向于脹亡是一個程序性的死亡方式，如抗Porimin的單抗可以引起Jurkat細(xì)胞的脹亡；解偶聯(lián)蛋白高表達(dá)的組織或細(xì)胞易發(fā)生脹亡，其原因是這些細(xì)胞缺乏ATP，故其膜上的離子泵功能喪失從而導(dǎo)致脹亡，而抑制解偶聯(lián)蛋白可以抵抗脹亡卻不能抵抗凋亡，提示脹亡可能有與凋亡不同的死

40、亡機制。,2008-04-23,50,新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式,1. 壞死性細(xì)胞凋亡（necroptosis）2. entosis,2008-04-23,51,壞死樣細(xì)胞凋亡（necroptosis）,壞死細(xì)胞凋亡是最近由美國袁筠英教授及其同事發(fā)現(xiàn)并證明的一種新現(xiàn)象。該現(xiàn)象發(fā)生在廣譜caspase抑制劑Z-VAD存在的條件下，TNFR1與其相應(yīng)的天然配體結(jié)合后發(fā)生的一種具有壞死樣形態(tài)特征和自噬活化作用的程序性細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步確定該現(xiàn)

41、象的存在，他們通過對大約15000種化合物的篩選，找到一種稱作necrostatin-1（Nec-1）的小分子化合物，能阻斷壞死樣細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟，而特異性地抑制壞死樣細(xì)胞凋亡。,2008-04-23,52,Entosis----2007年“細(xì)胞死亡”新發(fā)現(xiàn),在2007年年底，哈佛醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，布萊根婦女醫(yī)院（Brigham and Women’s Hospital），貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心（Beth Israel Dea

42、coness Medical Center，BIDMC）的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種全新的，奇異的細(xì)胞侵入細(xì)胞的死亡過程，并命名為entosis，即“Within”，“inside”的希臘文。這一研究成果公布在《Cell》雜志上。,2008-04-23,53,背景介紹,幾十年來，科學(xué)家曾偶爾觀察到有些細(xì)胞卷入到其他細(xì)胞中的情況，但均沒有進(jìn)一步研究。美國哈佛醫(yī)學(xué)院的細(xì)胞生物學(xué)家Michael Overholtzer和小組在研究正常乳腺細(xì)胞的時候

43、發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生長在基膜上的乳腺細(xì)胞分離后，有些細(xì)胞被包裹進(jìn)了另外的細(xì)胞中。新發(fā)現(xiàn)的這種細(xì)胞死亡方式不同于細(xì)胞凋亡，不會在細(xì)胞膜和細(xì)胞核分裂過程中產(chǎn)生不規(guī)則隆起，而是有些細(xì)胞會進(jìn)入到其它細(xì)胞中，導(dǎo)致死亡 。,2008-04-23,54,用紅、綠熒光染料標(biāo)記示蹤細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示小細(xì)胞陷入到大細(xì)胞中。,,2008-04-23,55,細(xì)胞entosis的超微結(jié)構(gòu),超微結(jié)構(gòu)研究顯示被卷入的細(xì)胞沒有顯示出凋亡或者壞死的特征，維持線粒體膜

44、電位的完整性。,2008-04-23,56,time-lapse microscopy（時間推移顯微鏡）觀察顯示，細(xì)胞內(nèi)陷大概在脫離基膜3-6h開始，需要經(jīng)歷幾小時完成。,2008-04-23,57,Bcl-2的過表達(dá)和caspase抑制劑能夠抑制細(xì)胞凋亡，但是對細(xì)胞的卷入或內(nèi)陷（internalizing）沒有影響。,細(xì)胞卷入不依賴于細(xì)胞凋亡過程。,2008-04-23,58,,經(jīng)過深入研究，研究小組發(fā)現(xiàn)，被卷入到別的細(xì)胞的乳腺分離細(xì)

45、胞中，有70%死亡，9%進(jìn)行了分裂，18%最后被完好無損地釋放出來。另外，阻止凋亡和噬菌作用等其他細(xì)胞死亡方式并不會中斷entosis，這證明了entosis具有獨特的作用機制。,2008-04-23,59,由于與基質(zhì)的分離（脫落）導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)陷，又叫entosis，不依賴于細(xì)胞凋亡，與caspase激活或者磷脂酰絲氨酸外翻無關(guān)，與基質(zhì)剝奪有關(guān)。entosis也不同于凋亡細(xì)胞的吞噬消化過程，但是依賴于細(xì)胞之間的粘著連接，是一個細(xì)胞侵入

46、另一個細(xì)胞的過程，詳細(xì)的機制不清楚。進(jìn)一步的實驗表明，保持細(xì)胞間相互連接的鈣黏著蛋白對于entosis是必需的。研究人員推測，當(dāng)細(xì)胞從基膜上分離時，它們之間支持力的不平衡導(dǎo)致了entosis的發(fā)生。,2008-04-23,60,有關(guān)entosis的意義爭論,Entosis是廣泛存在的。在多種細(xì)胞類型中，包括乳腺、卵巢、臍帶、腎癌細(xì)胞等，均發(fā)現(xiàn)了它存在的證據(jù)。Overholtzer認(rèn)為，entosis可能的一個功能是抑制腫瘤。因為當(dāng)在

47、乳腺癌細(xì)胞系中用化學(xué)制劑抑制entosis后，細(xì)胞群落形成(試管中腫瘤生長的指示劑)增長了10倍。 相反，美國?？怂?#183;蔡斯癌癥中心的分子生物學(xué)家Maureen Murphy認(rèn)為，entosis可能被癌細(xì)胞用作存活的工具，癌細(xì)胞利用它來逃脫化學(xué)藥物和免疫系統(tǒng)的識別。這也可能解釋了為什么不是所有經(jīng)歷entosis期的分子都會死亡。,2008-04-23,61,結(jié)語,隨著對細(xì)胞死亡的深入研究，越來越多的新的細(xì)胞死亡方式正逐漸被發(fā)現(xiàn)