海洋膠原肽對傷口愈合的研究

1、海洋膠原肽對大鼠剖宮產(chǎn)術(shù)后傷口愈合的影響,,提綱,一、研究背景二、研究目的三、材料和方法四、結(jié)果五、討論六、結(jié)論七、致謝,一、研究背景,1.剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀2.剖宮產(chǎn)的并發(fā)癥3.傷口愈合不良的危害4.傷口愈合的過程5.治療現(xiàn)狀6.膠原蛋白7.海洋膠原肽(MCP),剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀,剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀,,,剖宮產(chǎn)的現(xiàn)狀,中國 20世紀(jì)90年代初城市剖宮產(chǎn)率達(dá)20%左右；自90年代中期開始快速攀升，90年代末國內(nèi)大城市醫(yī)院的剖

2、宮產(chǎn)率即已達(dá)到30%～40%；目前雖無全國統(tǒng)計數(shù)據(jù)，但大多數(shù)城市醫(yī)院報道的剖宮產(chǎn)率約在40%～60%，高者甚至達(dá)60%～80%以上。,剖宮產(chǎn)的并發(fā)癥,近期：麻醉意外、術(shù)后出血、產(chǎn)后感染、肺栓塞遠(yuǎn)期：盆腔粘連、子宮內(nèi)膜異位癥、影響子宮的解剖結(jié)構(gòu)、對身體及各器官的影響、再孕時剖宮產(chǎn)切口瘢痕處妊娠、子宮破裂,傷口愈合不良的危害,若傷口愈合不良，將給產(chǎn)婦帶來術(shù)中術(shù)后出血、術(shù)后切口感染、切口裂開等危害，并增加慢性盆腔痛、盆腔粘連、子宮內(nèi)膜異位

3、癥、剖宮產(chǎn)瘢痕妊娠(CSP)、繼發(fā)不育、流產(chǎn)的發(fā)生率。,傷口愈合過程,治療現(xiàn)狀,基因工程的應(yīng)用生物工程材料的使用納米技術(shù)的應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合技術(shù)的應(yīng)用創(chuàng)面覆蓋物的應(yīng)用營養(yǎng)輔助治療激光刺激高壓氧治療其他治療方法: 心理治療、 真空輔助創(chuàng)口愈合技術(shù),膠原蛋白,膠原蛋白體外應(yīng)用有改善表皮細(xì)胞微循環(huán)和促進(jìn)皮膚組織新陳代謝的作用，從而加速組織再生與修復(fù)。膠原蛋白含有豐富的細(xì)胞代謝所需的氨基酸，可改善皮膚細(xì)胞的生存環(huán)境，促進(jìn)皮膚組織的

4、新陳代謝。,海洋膠原肽(MCP),海洋膠原肽：氨基酸組成均衡、全面，有很好的溶解性、低黏度、高濃度、水溶性、熱穩(wěn)定性，在體內(nèi)吸收快、利用率高。國內(nèi)外已有部分研究論證了海洋生物活性肽對實驗動物具有抗損傷和抗氧化等功效。我們課題組以往的研究表明：海洋低聚肽具有延緩皮膚衰老、保護(hù)腎功能、調(diào)節(jié)血糖、改善老年記憶、調(diào)節(jié)免疫、防輻射及預(yù)防骨質(zhì)疏松的活性；海洋膠原肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以清除體內(nèi)的自由基，減少炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)小鼠免疫功能，進(jìn)而增

5、強(qiáng)抗感染能力。,二、研究目的,觀察MCP對傷口愈合的影響 探討MCP促進(jìn)愈合的作用機(jī)制,三、材料和方法,受試物：海洋膠原肽 淡黃色粉末，由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供。以深海魚的魚皮為主要原料，經(jīng)過清洗勻漿-復(fù)合偶聯(lián)酶解-酶失活-脫脂-多級膜分離-滲透精制-濃縮-脫色-造粒干燥等工藝制成。 根據(jù)我們課題組以往實驗及預(yù)實驗的結(jié)果，設(shè)立0.13g/kg.bw、0.38g/kg.bw、1.15g/kg.

6、bw三個MCP劑量組，對照組給予等體積溶劑灌胃。,材料,實驗動物孕16天的健康SD大鼠350~400gSPF級動物房飼養(yǎng)飼養(yǎng)環(huán)境溫度21~23℃濕度50%~60%RH,材料,主要儀器,UV7512GD型紫外可見分光光度計超速離心機(jī)XHC型漩渦混勻器電子天平光學(xué)顯微鏡－80℃低溫冰箱Pclab-UE生物醫(yī)學(xué)信號采集處理系統(tǒng),主要試劑,羥脯氨酸測試盒FGF抗體TGF-β1抗體CD31兔二步法免疫組化檢測試劑盒

7、濃縮型DAB試劑盒其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純,實驗方法,動物分組及處理96只孕16天的SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組24只，均給予基礎(chǔ)飼料。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，在孕19天進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)，手術(shù)當(dāng)天在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上增加灌胃。低劑量MCP組，術(shù)后每天給予0.13 g/kg.bw劑量的海洋膠原肽灌胃；中劑量MCP組，術(shù)后每天給予0.38g/kg.bw劑量的海洋膠原肽灌胃；高劑量MCP組，術(shù)后每天給予1.15g/kg.bw劑量的海洋膠原

8、肽灌胃；空白對照組，術(shù)后每天灌胃相同體積的生理鹽水。,實驗方法,手術(shù)方案 1%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在下腹部沿腹中線切開3cm 縱切口，打開腹腔，在兩側(cè)子宮背對腸系膜側(cè)的中部各做2.0cm的縱向切口，擠出大鼠幼崽和胎盤。用5-0可吸收性外科腸線連續(xù)縫合，深腹、筋膜、腹膜用4-0絲線縫合，皮膚用4-0絲線縫合。術(shù)后涂2%碘酊，注射青霉素0.1ml，放回鼠籠里，注意保暖，術(shù)后禁食1天，正常飲水。,實驗方法,樣品的收集在術(shù)后7天、14天

9、、21天每組分別取8只大鼠，頸椎脫臼法處死動物，取傷口皮膚、子宮組織，稱重后，1/2用于測量力學(xué)指標(biāo)，1/4放入液氮中迅速冷凍，-80℃冰箱中保存。剩下的1/4組織用10%中性甲醛固定后，備用。,觀察指標(biāo),一般指標(biāo)：大鼠的一般情況、傷口愈合的時間、肉眼觀察情況。每周記錄大鼠體重及攝食量，每3天測量大鼠腰圍，臟器收集時觀察腹部的粘連情況，對粘連情況進(jìn)行分級判斷，同時記錄子宮重量。力學(xué)指標(biāo)：皮膚張力和子宮破裂壓力。羥脯氨酸含量：樣本堿水

10、解法。病理組織學(xué)檢查： HE染色、膠原染色。細(xì)胞因子的表達(dá)：免疫組織化學(xué)染色。,統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x?s)表示數(shù)據(jù)采用SPSS13.0處理計量資料采用T檢驗、單因素方差分析組間的粘連情況采用秩和檢驗檢驗水平α=0.05,四、實驗結(jié)果,1 一般指標(biāo)1.1 大鼠的一般情況實驗期間各組大鼠無死亡，未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，動物生長及活動正常，行為、毛色、精神狀況、飲食、飲水及糞便均未見明顯異常。,1.2傷口愈合時

11、間與肉眼觀察情況,,傷口的平均愈合時間為6~7d。灌胃海洋膠原肽實驗組大鼠的傷口，比對照組大鼠傷口能提前1-2天愈合。,,肉眼觀察傷口愈合良好，未發(fā)現(xiàn)紅腫、積液、皮膚壞死、切口破裂等不良反應(yīng)。MCP組傷口愈合后，與對照組相比，傷口表面光滑無結(jié)痂。因此認(rèn)為膠原肽對傷口愈合起著顯著的愈合作用。,1.3 對大鼠體重及攝食量的影響,體重數(shù)據(jù)顯示各實驗組大鼠的體重顯現(xiàn)出先減少再增加的趨勢，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。,,

12、1.4 對大鼠腰圍的影響,各實驗組大鼠的腰圍均呈現(xiàn)出一個先下降后回升至穩(wěn)定水平的趨勢，各MCP劑量組數(shù)據(jù)與空白對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。,1.5 對大鼠腹部粘連情況的影響,對大鼠腹部的粘連情況進(jìn)行分級，大鼠多為中度粘連，采用單向有序分類變量秩和檢驗，檢驗統(tǒng)計量Hc=0.359， p＞0.05，可以認(rèn)為，各實驗組大鼠腹部粘連情況的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。,1.6 對大鼠子宮重量的影響,2 力學(xué)指標(biāo),對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分

13、析，結(jié)果表明中劑量組在21天時皮膚張力高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；高劑量組7天和21天的皮膚張力均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。,2 力學(xué)指標(biāo),子宮壓力的數(shù)據(jù)表明，低劑量組和中劑量組的子宮壓力與空白對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。而高劑量組在在7天、21天時子宮壓力均大于對照組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。,3 對羥脯氨酸含量的影響,4 組織病理學(xué)檢查,

14、鏡下可見較多的中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間質(zhì)疏松，新生的毛細(xì)血管芽和成纖維細(xì)胞增生不明顯。,鏡下可見較多的中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，有新生的毛細(xì)血管芽和成纖維細(xì)胞增生。大量成纖維細(xì)胞呈梭狀，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞核較大，呈橢圓形，核仁明顯。,HE染色：術(shù)后14天,鏡下可見仍有較多炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)長梭狀的纖維細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯，膠原纖維增生不明顯。,鏡下可見大量細(xì)長梭狀纖維細(xì)胞和大量束狀排列膠原

15、纖維增生。,HE染色：術(shù)后第21天,傷口表皮以增生為主，瘢痕組織較多，炎性細(xì)胞浸潤較多。,傷口表皮完整，瘢痕組織明顯少于對照組，炎性細(xì)胞明顯減少。,膠原染色,MCP組有大量膠原纖維束及波浪形的彈性纖維， MCP組膠原纖維數(shù)量明顯多于對照組，且排列整齊。,5 免疫組化檢測細(xì)胞因子的表達(dá),5.1 傷口組織中TGF-β1的表達(dá),,術(shù)后第14、21天的傷口組織中TGF-β1表達(dá)顯著高于對照組(p<0.05)。,5.2 傷口組織中bFGF的

16、表達(dá),術(shù)后第7、14天高劑量組傷口組織中bFGF的表達(dá)均高于空白對照組，差異有顯著性(p<0.05)。,5.3 傷口組織中CD31的表達(dá),CD31陽性反應(yīng)出現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，用來標(biāo)記微血管，7d時達(dá)到峰值，之后便呈減少趨勢，14、21d沒有發(fā)現(xiàn)差異性。,五、討論,1 關(guān)于動物模型和指標(biāo)的選擇 動物模型：對孕鼠進(jìn)行剖宮產(chǎn)術(shù)，建立剖宮產(chǎn)術(shù)動物模型，模擬了臨床剖宮產(chǎn)情況，形成組織形態(tài)與生物學(xué)與人剖宮產(chǎn)近似的傷口組織，再現(xiàn)了剖宮產(chǎn)術(shù)

17、后傷口愈合的過程。剖宮產(chǎn)動物模型在國內(nèi)外應(yīng)用較少，本實驗創(chuàng)新性的將剖宮產(chǎn)術(shù)大鼠模型應(yīng)用于MCP對傷口愈合影響的研究，這在國內(nèi)尚屬首例。 力學(xué)指標(biāo)：在本研究中，我們基于剖宮產(chǎn)術(shù)動物模型的基礎(chǔ)上，由力學(xué)角度分析MCP對傷口愈合的影響，新增加了皮膚張力和子宮破裂壓力指標(biāo)的測定，二者都是定量的指標(biāo)，能夠更加準(zhǔn)確的反應(yīng)皮膚和子宮傷口抗拉力和伸展強(qiáng)度，明確判斷傷口愈合的好壞，正確的反應(yīng)MCP對傷口愈合的影響，使得本實驗的結(jié)果更加科學(xué)、可信度

18、較強(qiáng)。,2 MCP對傷口愈合的作用,2.1 對一般情況的影響實驗期間大鼠無死亡，狀態(tài)良好，一般情況及病理均未出現(xiàn)明顯異常，說明MCP在本試驗劑量范圍內(nèi)是安全的，對動物不產(chǎn)生毒副作用。各劑量組和空白對照組的體重、腰圍、攝食量、子宮重量沒有統(tǒng)計學(xué)差異，并且體重、腰圍、及子宮重量的變化均呈現(xiàn)出由高到低的變化趨勢，與各個時間點的生理狀況相吻合，符合孕鼠產(chǎn)后身體及子宮復(fù)舊的正常生理變化，說明MCP不影響孕鼠正常的身體恢復(fù)。,2 MCP對傷口

19、愈合的作用,2.2 縮短傷口愈合時間 本研究結(jié)果表明MCP組大鼠傷口愈合的時間明顯小于對照組，這說明MCP可以縮短傷口組織愈合的時間，減少產(chǎn)婦術(shù)后傷口治療的過程，對于減少住院時間，降低醫(yī)療費用有一定的意義。2.3 增加傷口組織的力學(xué)指標(biāo) 本研究結(jié)果表明MCP能增加術(shù)后傷口皮膚張力和子宮破裂壓力，這對于剖宮產(chǎn)婦來說極為重要。術(shù)后傷口皮膚張力和子宮破裂壓力的增加，意味著產(chǎn)婦術(shù)后傷口愈合良好，皮膚的伸展性恢復(fù)得較好，抗拉

20、力的強(qiáng)度增大，可以承受住剖宮產(chǎn)術(shù)后再次妊娠，從而減少CSP的發(fā)生，降低剖宮產(chǎn)術(shù)后再次妊娠的風(fēng)險。,2 MCP對傷口愈合的作用,2.4 對傷口組織形態(tài)學(xué)的影響MCP能增加早期傷口組織中新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞的生成，縮短傷口愈合過程中的炎癥反應(yīng)期，促進(jìn)傷口組織成纖維細(xì)胞及早形成，促進(jìn)血管再生，從而改善傷口組織中微循環(huán)，增加局部供氧，促進(jìn)微血管和膠原生成，加快傷口愈合。,3 MCP促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,1 增加氨基酸原料的供給。

21、 創(chuàng)傷愈合的一個重要過程，是成纖維細(xì)胞利用氨基酸原料，合成膠原蛋白，如果氨基酸原料供給不足，必將造成愈合延遲。羥脯氨酸是構(gòu)成結(jié)締組織膠原的重要成分，對膠原蛋白分子在生理溫度下形成三股螺旋的繩狀結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性具有重要意義，其含量多少與結(jié)締組織的抗拉力強(qiáng)度有很大關(guān)系。本研究中高劑量組皮膚傷口中羥脯氨酸的含量在3個時間點上均高于對照組，說明MCP能夠能夠提供充足的氨基酸原料，促進(jìn)傷口中羥脯氨酸含量的增加，從而利于膠原蛋白的合成，增加膠原蛋白

22、分子的穩(wěn)定性，增強(qiáng)皮膚的抗拉力強(qiáng)度，促進(jìn)傷口愈合。我們課題組以往的研究表明MCP可通過促進(jìn)傷口皮膚膠原蛋白的合成，從而促進(jìn)傷口愈合，結(jié)論與本研究相一致。,3 MCP促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,2 促進(jìn)傷口愈合的修復(fù)細(xì)胞的形成，特別是增加參與肉芽組織形成的成纖維細(xì)胞。 本實驗傷口7天的病理學(xué)檢查和免疫組化結(jié)果均表明成纖維細(xì)胞的數(shù)量和膠原纖維的含量明顯增加，MCP可通過增加成纖維細(xì)胞的數(shù)量和膠原纖維的含量，從而促進(jìn)傷口的愈合。,3 MCP

23、促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,3 為皮膚提供營養(yǎng)物質(zhì)。 傷口愈合的過程需要以營養(yǎng)為基礎(chǔ)，而MCP可以增加新生血管的形成，改善血循環(huán)，增加傷口組織局部營養(yǎng)，為傷口愈合提供充足的營養(yǎng)。4 縮短愈合過程中的炎性反應(yīng)期。 MCP可在早期增加傷口組織中炎性細(xì)胞的浸潤，縮短愈合過程中的炎性反應(yīng)期，從而縮短愈合時間，促進(jìn)傷口愈合。,3 MCP促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制,5 促進(jìn)生長因子表達(dá)。 本實驗結(jié)果表明MCP可以增強(qiáng)TGF-β1、bFGF、

24、CD31的表達(dá)，提示在傷口的愈合過程中：（1）MCP可能通過增強(qiáng)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)產(chǎn)生膠原纖維和ECM，誘導(dǎo)肉芽組織生長和表皮形成，來促進(jìn)傷口的愈合。（2）MCP可增強(qiáng)傷口組織中bFGF的表達(dá)，并維持在較高的水平，從而增加新生血管的形成，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增生，參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，縮短傷口愈合時間，促進(jìn)傷口的愈合。（3）MCP組微血管計數(shù)（CD31）在7d時顯著高于對照組，而且病理學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)術(shù)后7dMCP組毛

25、細(xì)血管數(shù)量最多，說明MCP能增加毛細(xì)血管的數(shù)量，為創(chuàng)面的快速愈合提供了良好的血供，從而促進(jìn)傷口的愈合。,六、結(jié) 論,MCP對傷口愈合有明顯的促進(jìn)作用MCP可以促進(jìn)膠原蛋白的合成MCP可以提高傷口皮膚的張力 MCP能增強(qiáng)子宮的壓力MCP可影響傷口組織中TGF-β1、bFGF、CD31的表達(dá)，通過促進(jìn)血管形成、炎癥反應(yīng)發(fā)揮其促進(jìn)傷口愈合的作用,,目前，剖宮產(chǎn)率居高不下并有逐漸升高的趨勢，傷口愈合不良，將減緩愈合過程，增加產(chǎn)后并發(fā)癥