牛海綿狀腦病

1、24牛海綿狀腦病,(Bovine Spongiforn Encephalopathy, BSE),1、前言,牛海綿狀腦病(Bovine Spongiforn Encephalopathy, BSE)俗稱瘋牛病, 它是一種類似腦病毒感染的傳染病, 以潛伏期長,病情逐漸加重, 終歸死亡為特征, 本病死亡率很高。首先發(fā)現(xiàn)的人類朊病毒疾病是庫魯病, 在動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)的是羊瘙癢病。 1985 年4月發(fā)現(xiàn), 1986 年11 月將該病定名為BSE。

2、,動(dòng)物及人的各種朊病毒病:,由于此病迄今尚無法治療, 又有傳染給人之可能性, 使人得一種病死率極高的中樞神經(jīng)退化病———新型克雅病(New V arientCreutzfeldt-Jakob disease, NV -CJD ), 因此, 瘋牛病不僅對經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失, 而且引起了全球?qū)Ο偱２〉目只拧?2、病原學(xué),朊病毒( Prion, 有人譯為朊?；螂玫鞍? 是一種特殊傳染因子, 它不同于一般病毒, 也不同于類病毒, 它沒有核酸, 而

3、是一種特殊的糖蛋白。用PrP 代表( Pr 代表Prion, P 代表Protein) 。,PrP,,PrPc:是正常細(xì)胞具有的，對蛋白酶敏感，易被其消化降解， 存在于細(xì)胞表面，無感染性。,PrPsc:當(dāng)結(jié)構(gòu)異常時(shí)，就成為另一類有致病性PrP，對蛋白酶K有一定抵抗力。,prpc與prpsc的對比:,生物學(xué)特性: 朊病毒是一種有兩種結(jié)構(gòu)型, 一種是prpc, 正常情況下存在于細(xì)胞表面, 無感染性, 可被蛋白酶K消化降解, 可溶于去垢

4、劑。當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)構(gòu)由α螺旋變構(gòu)成β片層結(jié)構(gòu)時(shí), 具有了致病性, 稱prpsc, 而不被蛋白酶分解, 不溶于去垢劑。,為什么會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢? 經(jīng)過深入研究, 發(fā)現(xiàn)一種稱為x 蛋白的物質(zhì)參與了這種轉(zhuǎn)變, 當(dāng)prpc 與prpsc 的第96 ～167 位氨基酸結(jié)合, 同時(shí)prpscC 端殘基再與x 蛋白結(jié)合, 這時(shí)促使prpc 變構(gòu)成prpsc。,3、流行病學(xué),BSE 患牛的比例:,最近, 美國和冰島的科學(xué)家對BSE 蔓延又有新解釋, 他們認(rèn)為

5、, BSE 的傳播與生活在農(nóng)場干草中的螨蟲有關(guān)。,4、臨床癥狀,BSE 和癢病在臨診上有許多相似的地方, 最大的區(qū)別是BSE 很少出現(xiàn)搔癢癥狀。神經(jīng)癥狀可分為三個(gè)類型。,驚恐不安，有攻擊性,,恐懼不安，狂奔,5、病理變化,牛海綿狀腦病無肉眼可見的病理變化, 也無生物學(xué)和血液學(xué)異常變化。典型的組織病理學(xué)和分子學(xué)變化都集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。牛海綿狀腦病有三個(gè)典型的非炎性病理變化:,病理變化,( 1) 星型細(xì)胞肥大常伴隨于空泡的形成,(2)牛海

6、綿狀腦病存在淀粉樣病變, 但不 多見,(3) 出現(xiàn)雙邊對稱的神經(jīng)空泡,,神經(jīng)纖維網(wǎng)空泡,核濃縮,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙,腦組織,分子病理學(xué)變化: 除了癢病家族應(yīng)有特征性組織病理變化外, 牛腦組織提取液中還含有大量的異常纖維( SAF) , 可用電鏡負(fù)染技術(shù)觀察到, 這對牛感染牛海綿狀腦病的確診非常重要。,6、診斷,機(jī)體感染BSE后既無任何炎癥, 也不產(chǎn)生免疫應(yīng)答, 所以該病至今尚無血清學(xué)診斷方法, 病牛的血液生化指標(biāo)也無顯著異常。

7、因此本病的診斷主要依據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和組織病理學(xué)進(jìn)行初診, 通過死后腦組織采樣, 檢測SAF以確診BSE。,6.1 　病理學(xué)方法,病理組織解剖及動(dòng)物傳遞傳染實(shí)驗(yàn)多用于發(fā)病后期及死后診斷，用任何新方法做出的陽性結(jié)果均需用此方法作以最終判定。,6. 1.1 組織病理學(xué)方法,是對BSE 感染的腦超薄切片進(jìn)行電子顯微鏡觀察，從而確診BSE 疾病的一種方法。但這種檢查一般是在疾病發(fā)展的后期進(jìn)行，難以實(shí)現(xiàn)BSE 的活體檢測。,6.1.2 動(dòng)

8、物試驗(yàn),動(dòng)物試驗(yàn)檢測方法主要通過用懷疑感染患者的主要病變組織提取物注射到易感動(dòng)物體內(nèi)，通過觀察易感動(dòng)物的癥狀來診斷PrPsc。同種動(dòng)物間的傳播效率最高，而不同種動(dòng)物間的傳播具有種屬屏障。,6.2　免疫學(xué)檢測,6.2.1 Western blot Western blot是現(xiàn)在常用的蛋白質(zhì)檢測方法。主要原理是PrPsc在蛋白酶K 作用下產(chǎn)生PrP27230, 而PrPc 會(huì)被完全消化, 用antiPrP27230 抗血清與PrP2

9、7230 進(jìn)行免疫反應(yīng)即可檢測出。由于樣品需要蛋白酶K 預(yù)處理, 則不可避免地造成PrPsc 和少量PrPc 降解, 影響了該法的敏感性。,6.2.2　ELISA,此法是在western blot基礎(chǔ)上建立的。進(jìn)行檢測時(shí), 由于經(jīng)蛋白酶K處理后, PrPsc 轉(zhuǎn)變生成P rP27230, 后者吸附于塑料表面, 免疫反應(yīng)性降低, 用硫氰酸胍變性后, 可使其表位充分暴露,免疫反應(yīng)性增強(qiáng)。,6.2.3　免疫組化,免疫組化是利用標(biāo)記的特異性抗體

10、來顯示組織切片上的PrPsc 。該法的主要原理是用單克隆抗體15B3 能區(qū)別PrPc和PrPsc, 并把PrPsc 沉淀而不沉淀PrPc, 可用于檢測PrPsc。該法不但可以定性、定位研究P rPsc，還可以做到定量。,6.2.4 免疫印跡檢測,以抗體T1對經(jīng)蛋白酶K消化的腦組織提取物進(jìn)行免疫反應(yīng)，根據(jù)消化后的樣品中是否含有抗蛋白酶K的PrPsc存在及其分子量的大小，就可以檢測機(jī)體是否被BSE 所感染。,6.2.5　蛋白錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)

11、增,該法由Saborio 等創(chuàng)立, 其主要是用類似于PCR 的原理體外擴(kuò)增PrPsc的方法, 稱之為蛋白錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA )。該法基于體外少量PrPsc能使大量PrPc構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)換, 生成PrPsc,形成PrPsc凝集物,用超聲處理后生成許多小的 PrPsc 單位, 再以這些小的單,位為“模板”, 以PrPc 為“原料”繼續(xù)合成PrPsc, 多次循環(huán)之后，擴(kuò)增產(chǎn)物中97% 以上的蛋白具有蛋白酶抗性, 蛋白酶消化后,w este

12、rn blot 檢測PrPc。該方法靈敏度高, 為PrPsc 的檢測開辟了新的領(lǐng)域。,6.3 　儀器檢測法,6.3.1 毛細(xì)管電泳 Schimerr 等(1999) 首次報(bào)道了毛細(xì)管電泳可以檢測TSE患者血液中PrPsc。其原理是將抗原抗體競爭試驗(yàn)與毛細(xì)管電泳結(jié)合起來。,6.3.2 光譜分析,目前光譜分析可分多光譜紫外熒光分析(MUFS) 和共聚焦雙色熒光相關(guān)波譜分析(FCS)兩種。光譜分析方法可直接檢測PrP sc, 不需要蛋

13、白酶K預(yù)處理。多光譜紫外熒光分析不需要借助于PK處理及特異性抗體就能直接檢測。,共聚焦雙色熒光相關(guān)波譜分析可檢測溶液中熒光標(biāo)記的單分子, 待檢分子發(fā)射的熒光光子被激光識(shí)別后, 聚在一個(gè)點(diǎn)上, 在單光子檢測上成像。,6.3.3 高效液相色譜,利用高效液相色譜檢測與PrPsc 相關(guān)的疾病。該法主要是利用高效液相色譜檢測prion 蛋白基因(PRNP)上某些與PrPsc相關(guān)的位點(diǎn)(如129位點(diǎn)) ,從而達(dá)到檢測PrP sc的目的。,7、 各

14、國檢測BSE的新方法,7.1 　奧地利 奧地利克普勒大學(xué)的科學(xué)家研制出用高靈敏度熒光顯微鏡和特殊抗體快速測定活牛BSE 的方法。朊病毒絕大部分集中在牛腦和脊髓里, 在牛血中其含量極其稀少。,克普勒大學(xué)研制出一種帶有發(fā)光的染料分子抗體, 這種抗體加入血樣后, 會(huì)附著在PrP 上。借助于高靈敏度的熒光顯微鏡, 就可以發(fā)現(xiàn)著色的PrP。,7.2 　法國,法國用單克隆抗體檢測人、牛、綿羊、鼠的PrP。與傳統(tǒng)檢驗(yàn)BSE的方法相比, 這種新的

15、檢測方法無需對牛進(jìn)行宰殺,在感染早期只需取出其部分大腦樣本即可, 也可用于死后檢測。,7.3 　德國,德國新發(fā)明了一種活體快速檢測方法。這種檢測法可以通過對活牛抽血化驗(yàn), 迅速確診牛是否已經(jīng)被感染。這個(gè)方法與檢查糖尿病用的血糖測試法相似。,先將BSE 抗體用發(fā)光劑標(biāo)記，然后將其與被檢牛的血樣混合接著用一種“洗滌劑”清洗掉其中的干擾成分。經(jīng)過發(fā)光劑處理的抗體會(huì)在血樣中尋找朊病毒，一旦發(fā)現(xiàn)就會(huì)立即標(biāo)識(shí)。,7.4 　瑞士,有研究表明海綿狀腦病

16、的神經(jīng)損傷可能是PrP與細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生作用所致，血纖維蛋白溶酶原就是這類物質(zhì)中的一種。瑞士蘇黎世大學(xué)醫(yī)院從人體和實(shí)驗(yàn)鼠的血清中分別提取血纖維蛋白溶酶原，將其涂在帶磁性的微珠上，然后將感染羊癢病的實(shí)驗(yàn)鼠腦組織提取物與磁珠混合，發(fā)現(xiàn)血纖維蛋白溶酶原可與PrP 結(jié)合。,7.5 英國,鑒于朊病毒侵入大腦前首先在脾臟復(fù)制, 通過分析正常小鼠脾臟和感染BSE 小鼠脾臟的大約10000份RNA轉(zhuǎn)錄物, 發(fā)現(xiàn)在感染小鼠的脾臟中，紅細(xì)胞分化相關(guān)因子

17、(EDRF) 的轉(zhuǎn)錄水平下降。不僅如此,患BSE牛的骨髓中，EDRF 水平同樣低于正常。但還不清楚朊病毒感染后EDRF減少的機(jī)理。據(jù)此原理，通過檢測血液中EDRF 水平來診斷BSE ， 在小鼠和羊試驗(yàn)成功。,7.6 美國和以色列,美國對vCJD、BSE 和其他傳染性海綿狀腦病的尿液檢驗(yàn)方法, 這種方法可準(zhǔn)確診斷BSE。一種獨(dú)特的、高度敏感的檢測技術(shù)———構(gòu)象依賴的免疫測定(CDI) , CDI 能有效地發(fā)現(xiàn)正常個(gè)體和捐獻(xiàn)的血漿中少量的朊

18、病毒。,7.7 我國BSE檢測現(xiàn)狀,我國在吸取了國外先進(jìn)技術(shù)的同時(shí)，檢測瘋牛病的方法也正日臻完善。目前，我國共有3 個(gè)國家級的BSE檢測實(shí)驗(yàn)室，即農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所(青島) 、北京出入境檢驗(yàn)檢疫局和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的BSE檢測實(shí)驗(yàn)室。北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心BSE 檢測實(shí)驗(yàn)室主要采用病理學(xué)方法、免疫組化法和免疫轉(zhuǎn)印法。,動(dòng)物檢疫所全國瘋牛病檢測中心從瑞士引進(jìn)了免疫轉(zhuǎn)印、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附測定等PrP免疫檢測技術(shù),目前主要采用免疫組化法

19、,因?yàn)樗臋z測成本比較低廉, 特別是試劑。,8、防制,由于目前該病沒有有效治療方法，主要以預(yù)防為主，為了控制本病，各國紛紛采取措施， 禁止從發(fā)生BSE的國家進(jìn)口牛、牛制品及反芻動(dòng)物性飼料，切斷BSE 的傳播途徑。我國為防止瘋牛病傳入, 也采取了一系列行之有效的措施, 早在1990 年6 月農(nóng)業(yè)部就印發(fā)了《關(guān)于嚴(yán)防牛海綿狀腦病傳入我國的通知》，決定停止從英國進(jìn)口牛、牛精,液、牛胚胎、牛肉、牛骨粉等，并禁止從有牛海綿狀腦病的國家進(jìn)口牛及其產(chǎn)

20、品。1992 年6 月，該病增列為《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中的一類傳染病，作為我國進(jìn)境動(dòng)物檢疫的重點(diǎn)防范對象。2001 年2 月14 日， 農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《中國瘋牛病風(fēng)險(xiǎn)分析與評估》報(bào)告，報(bào)告認(rèn)為由于管理嚴(yán)格，我國尚無發(fā)生傳播瘋牛病的基本要素，報(bào)告結(jié)論是我國目前沒有瘋牛病。,盡管如此，當(dāng)今防止國外瘋牛病傳入我國，仍然是一個(gè)不容忽視的重大問題，這不僅事關(guān)全國人民生命和畜牧業(yè)健康發(fā)展，而且關(guān)系到社會(huì)和政治穩(wěn)定大局