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1、24牛海綿狀腦病,(Bovine Spongiforn Encephalopathy, BSE),1、前言,牛海綿狀腦病(Bovine Spongiforn Encephalopathy, BSE)俗稱(chēng)瘋牛病, 它是一種類(lèi)似腦病毒感染的傳染病, 以潛伏期長(zhǎng),病情逐漸加重, 終歸死亡為特征, 本病死亡率很高。首先發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)朊病毒疾病是庫(kù)魯病, 在動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)的是羊瘙癢病。 1985 年4月發(fā)現(xiàn), 1986 年11 月將該病定名為BSE。
2、,動(dòng)物及人的各種朊病毒病:,由于此病迄今尚無(wú)法治療, 又有傳染給人之可能性, 使人得一種病死率極高的中樞神經(jīng)退化病———新型克雅病(New V arientCreutzfeldt-Jakob disease, NV -CJD ), 因此, 瘋牛病不僅對(duì)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失, 而且引起了全球?qū)Ο偱2〉目只拧?2、病原學(xué),朊病毒( Prion, 有人譯為朊?;螂玫鞍? 是一種特殊傳染因子, 它不同于一般病毒, 也不同于類(lèi)病毒, 它沒(méi)有核酸, 而
3、是一種特殊的糖蛋白。用PrP 代表( Pr 代表Prion, P 代表Protein) 。,PrP,,PrPc:是正常細(xì)胞具有的,對(duì)蛋白酶敏感,易被其消化降解, 存在于細(xì)胞表面,無(wú)感染性。,PrPsc:當(dāng)結(jié)構(gòu)異常時(shí),就成為另一類(lèi)有致病性PrP,對(duì)蛋白酶K有一定抵抗力。,prpc與prpsc的對(duì)比:,生物學(xué)特性: 朊病毒是一種有兩種結(jié)構(gòu)型, 一種是prpc, 正常情況下存在于細(xì)胞表面, 無(wú)感染性, 可被蛋白酶K消化降解, 可溶于去垢
4、劑。當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)構(gòu)由α螺旋變構(gòu)成β片層結(jié)構(gòu)時(shí), 具有了致病性, 稱(chēng)prpsc, 而不被蛋白酶分解, 不溶于去垢劑。,為什么會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢? 經(jīng)過(guò)深入研究, 發(fā)現(xiàn)一種稱(chēng)為x 蛋白的物質(zhì)參與了這種轉(zhuǎn)變, 當(dāng)prpc 與prpsc 的第96 ~167 位氨基酸結(jié)合, 同時(shí)prpscC 端殘基再與x 蛋白結(jié)合, 這時(shí)促使prpc 變構(gòu)成prpsc。,3、流行病學(xué),BSE 患牛的比例:,最近, 美國(guó)和冰島的科學(xué)家對(duì)BSE 蔓延又有新解釋, 他們認(rèn)為
5、, BSE 的傳播與生活在農(nóng)場(chǎng)干草中的螨蟲(chóng)有關(guān)。,4、臨床癥狀,BSE 和癢病在臨診上有許多相似的地方, 最大的區(qū)別是BSE 很少出現(xiàn)搔癢癥狀。神經(jīng)癥狀可分為三個(gè)類(lèi)型。,驚恐不安,有攻擊性,,恐懼不安,狂奔,5、病理變化,牛海綿狀腦病無(wú)肉眼可見(jiàn)的病理變化, 也無(wú)生物學(xué)和血液學(xué)異常變化。典型的組織病理學(xué)和分子學(xué)變化都集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。牛海綿狀腦病有三個(gè)典型的非炎性病理變化:,病理變化,( 1) 星型細(xì)胞肥大常伴隨于空泡的形成,(2)牛海
6、綿狀腦病存在淀粉樣病變, 但不 多見(jiàn),(3) 出現(xiàn)雙邊對(duì)稱(chēng)的神經(jīng)空泡,,神經(jīng)纖維網(wǎng)空泡,核濃縮,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙,腦組織,分子病理學(xué)變化: 除了癢病家族應(yīng)有特征性組織病理變化外, 牛腦組織提取液中還含有大量的異常纖維( SAF) , 可用電鏡負(fù)染技術(shù)觀察到, 這對(duì)牛感染牛海綿狀腦病的確診非常重要。,6、診斷,機(jī)體感染BSE后既無(wú)任何炎癥, 也不產(chǎn)生免疫應(yīng)答, 所以該病至今尚無(wú)血清學(xué)診斷方法, 病牛的血液生化指標(biāo)也無(wú)顯著異常。
7、因此本病的診斷主要依據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和組織病理學(xué)進(jìn)行初診, 通過(guò)死后腦組織采樣, 檢測(cè)SAF以確診BSE。,6.1 病理學(xué)方法,病理組織解剖及動(dòng)物傳遞傳染實(shí)驗(yàn)多用于發(fā)病后期及死后診斷,用任何新方法做出的陽(yáng)性結(jié)果均需用此方法作以最終判定。,6. 1.1 組織病理學(xué)方法,是對(duì)BSE 感染的腦超薄切片進(jìn)行電子顯微鏡觀察,從而確診BSE 疾病的一種方法。但這種檢查一般是在疾病發(fā)展的后期進(jìn)行,難以實(shí)現(xiàn)BSE 的活體檢測(cè)。,6.1.2 動(dòng)
8、物試驗(yàn),動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)方法主要通過(guò)用懷疑感染患者的主要病變組織提取物注射到易感動(dòng)物體內(nèi),通過(guò)觀察易感動(dòng)物的癥狀來(lái)診斷PrPsc。同種動(dòng)物間的傳播效率最高,而不同種動(dòng)物間的傳播具有種屬屏障。,6.2 免疫學(xué)檢測(cè),6.2.1 Western blot Western blot是現(xiàn)在常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。主要原理是PrPsc在蛋白酶K 作用下產(chǎn)生PrP27230, 而PrPc 會(huì)被完全消化, 用antiPrP27230 抗血清與PrP2
9、7230 進(jìn)行免疫反應(yīng)即可檢測(cè)出。由于樣品需要蛋白酶K 預(yù)處理, 則不可避免地造成PrPsc 和少量PrPc 降解, 影響了該法的敏感性。,6.2.2 ELISA,此法是在western blot基礎(chǔ)上建立的。進(jìn)行檢測(cè)時(shí), 由于經(jīng)蛋白酶K處理后, PrPsc 轉(zhuǎn)變生成P rP27230, 后者吸附于塑料表面, 免疫反應(yīng)性降低, 用硫氰酸胍變性后, 可使其表位充分暴露,免疫反應(yīng)性增強(qiáng)。,6.2.3 免疫組化,免疫組化是利用標(biāo)記的特異性抗體
10、來(lái)顯示組織切片上的PrPsc 。該法的主要原理是用單克隆抗體15B3 能區(qū)別PrPc和PrPsc, 并把PrPsc 沉淀而不沉淀PrPc, 可用于檢測(cè)PrPsc。該法不但可以定性、定位研究P rPsc,還可以做到定量。,6.2.4 免疫印跡檢測(cè),以抗體T1對(duì)經(jīng)蛋白酶K消化的腦組織提取物進(jìn)行免疫反應(yīng),根據(jù)消化后的樣品中是否含有抗蛋白酶K的PrPsc存在及其分子量的大小,就可以檢測(cè)機(jī)體是否被BSE 所感染。,6.2.5 蛋白錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)
11、增,該法由Saborio 等創(chuàng)立, 其主要是用類(lèi)似于PCR 的原理體外擴(kuò)增PrPsc的方法, 稱(chēng)之為蛋白錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA )。該法基于體外少量PrPsc能使大量PrPc構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)換, 生成PrPsc,形成PrPsc凝集物,用超聲處理后生成許多小的 PrPsc 單位, 再以這些小的單,位為“模板”, 以PrPc 為“原料”繼續(xù)合成PrPsc, 多次循環(huán)之后,擴(kuò)增產(chǎn)物中97% 以上的蛋白具有蛋白酶抗性, 蛋白酶消化后,w este
12、rn blot 檢測(cè)PrPc。該方法靈敏度高, 為PrPsc 的檢測(cè)開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。,6.3 儀器檢測(cè)法,6.3.1 毛細(xì)管電泳 Schimerr 等(1999) 首次報(bào)道了毛細(xì)管電泳可以檢測(cè)TSE患者血液中PrPsc。其原理是將抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)與毛細(xì)管電泳結(jié)合起來(lái)。,6.3.2 光譜分析,目前光譜分析可分多光譜紫外熒光分析(MUFS) 和共聚焦雙色熒光相關(guān)波譜分析(FCS)兩種。光譜分析方法可直接檢測(cè)PrP sc, 不需要蛋
13、白酶K預(yù)處理。多光譜紫外熒光分析不需要借助于PK處理及特異性抗體就能直接檢測(cè)。,共聚焦雙色熒光相關(guān)波譜分析可檢測(cè)溶液中熒光標(biāo)記的單分子, 待檢分子發(fā)射的熒光光子被激光識(shí)別后, 聚在一個(gè)點(diǎn)上, 在單光子檢測(cè)上成像。,6.3.3 高效液相色譜,利用高效液相色譜檢測(cè)與PrPsc 相關(guān)的疾病。該法主要是利用高效液相色譜檢測(cè)prion 蛋白基因(PRNP)上某些與PrPsc相關(guān)的位點(diǎn)(如129位點(diǎn)) ,從而達(dá)到檢測(cè)PrP sc的目的。,7、 各
14、國(guó)檢測(cè)BSE的新方法,7.1 奧地利 奧地利克普勒大學(xué)的科學(xué)家研制出用高靈敏度熒光顯微鏡和特殊抗體快速測(cè)定活牛BSE 的方法。朊病毒絕大部分集中在牛腦和脊髓里, 在牛血中其含量極其稀少。,克普勒大學(xué)研制出一種帶有發(fā)光的染料分子抗體, 這種抗體加入血樣后, 會(huì)附著在PrP 上。借助于高靈敏度的熒光顯微鏡, 就可以發(fā)現(xiàn)著色的PrP。,7.2 法國(guó),法國(guó)用單克隆抗體檢測(cè)人、牛、綿羊、鼠的PrP。與傳統(tǒng)檢驗(yàn)BSE的方法相比, 這種新的
15、檢測(cè)方法無(wú)需對(duì)牛進(jìn)行宰殺,在感染早期只需取出其部分大腦樣本即可, 也可用于死后檢測(cè)。,7.3 德國(guó),德國(guó)新發(fā)明了一種活體快速檢測(cè)方法。這種檢測(cè)法可以通過(guò)對(duì)活牛抽血化驗(yàn), 迅速確診牛是否已經(jīng)被感染。這個(gè)方法與檢查糖尿病用的血糖測(cè)試法相似。,先將BSE 抗體用發(fā)光劑標(biāo)記,然后將其與被檢牛的血樣混合接著用一種“洗滌劑”清洗掉其中的干擾成分。經(jīng)過(guò)發(fā)光劑處理的抗體會(huì)在血樣中尋找朊病毒,一旦發(fā)現(xiàn)就會(huì)立即標(biāo)識(shí)。,7.4 瑞士,有研究表明海綿狀腦病
16、的神經(jīng)損傷可能是PrP與細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生作用所致,血纖維蛋白溶酶原就是這類(lèi)物質(zhì)中的一種。瑞士蘇黎世大學(xué)醫(yī)院從人體和實(shí)驗(yàn)鼠的血清中分別提取血纖維蛋白溶酶原,將其涂在帶磁性的微珠上,然后將感染羊癢病的實(shí)驗(yàn)鼠腦組織提取物與磁珠混合,發(fā)現(xiàn)血纖維蛋白溶酶原可與PrP 結(jié)合。,7.5 英國(guó),鑒于朊病毒侵入大腦前首先在脾臟復(fù)制, 通過(guò)分析正常小鼠脾臟和感染BSE 小鼠脾臟的大約10000份RNA轉(zhuǎn)錄物, 發(fā)現(xiàn)在感染小鼠的脾臟中,紅細(xì)胞分化相關(guān)因子
17、(EDRF) 的轉(zhuǎn)錄水平下降。不僅如此,患BSE牛的骨髓中,EDRF 水平同樣低于正常。但還不清楚朊病毒感染后EDRF減少的機(jī)理。據(jù)此原理,通過(guò)檢測(cè)血液中EDRF 水平來(lái)診斷BSE , 在小鼠和羊試驗(yàn)成功。,7.6 美國(guó)和以色列,美國(guó)對(duì)vCJD、BSE 和其他傳染性海綿狀腦病的尿液檢驗(yàn)方法, 這種方法可準(zhǔn)確診斷BSE。一種獨(dú)特的、高度敏感的檢測(cè)技術(shù)———構(gòu)象依賴(lài)的免疫測(cè)定(CDI) , CDI 能有效地發(fā)現(xiàn)正常個(gè)體和捐獻(xiàn)的血漿中少量的朊
18、病毒。,7.7 我國(guó)BSE檢測(cè)現(xiàn)狀,我國(guó)在吸取了國(guó)外先進(jìn)技術(shù)的同時(shí),檢測(cè)瘋牛病的方法也正日臻完善。目前,我國(guó)共有3 個(gè)國(guó)家級(jí)的BSE檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室,即農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所(青島) 、北京出入境檢驗(yàn)檢疫局和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的BSE檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心BSE 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室主要采用病理學(xué)方法、免疫組化法和免疫轉(zhuǎn)印法。,動(dòng)物檢疫所全國(guó)瘋牛病檢測(cè)中心從瑞士引進(jìn)了免疫轉(zhuǎn)印、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等PrP免疫檢測(cè)技術(shù),目前主要采用免疫組化法
19、,因?yàn)樗臋z測(cè)成本比較低廉, 特別是試劑。,8、防制,由于目前該病沒(méi)有有效治療方法,主要以預(yù)防為主,為了控制本病,各國(guó)紛紛采取措施, 禁止從發(fā)生BSE的國(guó)家進(jìn)口牛、牛制品及反芻動(dòng)物性飼料,切斷BSE 的傳播途徑。我國(guó)為防止瘋牛病傳入, 也采取了一系列行之有效的措施, 早在1990 年6 月農(nóng)業(yè)部就印發(fā)了《關(guān)于嚴(yán)防牛海綿狀腦病傳入我國(guó)的通知》,決定停止從英國(guó)進(jìn)口牛、牛精,液、牛胚胎、牛肉、牛骨粉等,并禁止從有牛海綿狀腦病的國(guó)家進(jìn)口牛及其產(chǎn)
20、品。1992 年6 月,該病增列為《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類(lèi)傳染病、寄生蟲(chóng)病名錄》中的一類(lèi)傳染病,作為我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫的重點(diǎn)防范對(duì)象。2001 年2 月14 日, 農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《中國(guó)瘋牛病風(fēng)險(xiǎn)分析與評(píng)估》報(bào)告,報(bào)告認(rèn)為由于管理嚴(yán)格,我國(guó)尚無(wú)發(fā)生傳播瘋牛病的基本要素,報(bào)告結(jié)論是我國(guó)目前沒(méi)有瘋牛病。,盡管如此,當(dāng)今防止國(guó)外瘋牛病傳入我國(guó),仍然是一個(gè)不容忽視的重大問(wèn)題,這不僅事關(guān)全國(guó)人民生命和畜牧業(yè)健康發(fā)展,而且關(guān)系到社會(huì)和政治穩(wěn)定大局
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