PCR技術(shù)在對(duì)典型有害藻類檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、近二十年來(lái),在我國(guó)水域中爆發(fā)有害藻華的次數(shù)呈上升趨勢(shì),其規(guī)模逐年擴(kuò)大,對(duì)人類的生產(chǎn)、生活構(gòu)成極大威脅,構(gòu)建快速檢測(cè)方法及預(yù)警機(jī)制已是迫在眉睫。本文主要研究了甲藻中不同生態(tài)類群的演化規(guī)律、建立熒光定量PCR和多重PCR方法分別用于對(duì)典型有害藻類——利瑪原甲藻和微囊藻的檢測(cè)。所得主要結(jié)論如下:
　　1.建立雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法用于針對(duì)利瑪原甲藻的快速檢測(cè)
　　首次建立雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法用于針

2、對(duì)利瑪原甲藻的快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中,先對(duì)純系培養(yǎng)的利瑪原甲藻的rDNA ITS和聚酮合酶(PKS)基因進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序后,再根據(jù)所獲取的基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針,初步建立雙重TaqMan探針快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,該方法檢測(cè)精度較高、重復(fù)性較好,基本滿足實(shí)際檢測(cè)的需求。這為今后建立對(duì)有害藻類的預(yù)警機(jī)制提供有力支持。
　　2.綜合利用PCR技術(shù)對(duì)微囊藻的檢測(cè)
　　針對(duì)有害藻類——微囊藻,建立多重PCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法

3、。選擇微囊藻毒素合成基因mcy、藻藍(lán)蛋白基因PC及ropC1作為目標(biāo)檢測(cè)片段,并通過(guò)對(duì)PCR最佳反應(yīng)條件的探尋、穩(wěn)定性測(cè)試、靈敏度測(cè)試及背景水樣干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)試,建立一整套成熟的多重PCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,常規(guī)多重PCR方法最低可檢測(cè)到1.146g/L的微囊藻基因組DNA,全細(xì)胞多重PCR方法檢測(cè)范圍在藻液濃度為10~1×106個(gè)/mL;在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中,針對(duì) PC、ropC1和mcyDJ序列,最低都可以檢測(cè)到1

4、個(gè)藻細(xì)胞。
　　綜合利用上述建立的兩種檢測(cè)方法,對(duì)采集自上海周邊的三大湖泊的水樣進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn),三大湖泊中所檢測(cè)出的微囊藻mcy基因主要集中在太湖流域和滴水湖,而在淀山湖中未被發(fā)現(xiàn)。
　　3.從SSUrDNA和線粒體cox1序列的層面初步分析甲藻中不同生態(tài)類群的演化規(guī)律。
　　應(yīng)用SSUrDNA和線粒體cox1序列研究甲藻中不同生態(tài)類群的演化關(guān)系。通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲取4株甲藻SSUrDNA及其線粒體co

5、x1部分片段,結(jié)合GeneBank中24株甲藻的相關(guān)序列,以Plasmodium falciparum為外群,構(gòu)建ML樹和NJ樹,并采用自展支持度評(píng)估進(jìn)化樹分支結(jié)構(gòu),通過(guò)計(jì)算后驗(yàn)概率評(píng)估進(jìn)化樹整體結(jié)構(gòu),應(yīng)用1sKH、SH、ELW和2sKH等方法評(píng)估兩株ML樹間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,在由上述兩序列構(gòu)建的進(jìn)化樹上,底棲原甲藻均未與浮游原甲藻聚類,且前溝藻具有獨(dú)特演化地位。表明聯(lián)合選擇SSU rDNA和線粒體cox1序列構(gòu)建的進(jìn)化樹在一定程度