白藜蘆醇短期內(nèi)干預(yù)對高脂模型小鼠脂代謝及SIRT1，PPARα，CYP7A1表達(dá)影響的實驗研究.pdf

1、近幾年來,我國城鄉(xiāng)居民的膳食、營養(yǎng)狀況有了明顯改善,營養(yǎng)不良和營養(yǎng)缺乏患病率繼續(xù)下降,但是營養(yǎng)過剩所引發(fā)的慢性非傳染性疾病問題卻日益突出。據(jù)2002年中國居民營養(yǎng)與健康現(xiàn)狀調(diào)查結(jié)果顯示,我國成人冠心病、高血壓患病率呈明顯上升趨勢,而血脂異常是動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。因此,預(yù)防和控制血脂異常有著十分重要的意義。
　　 法國人的飲食中含有大量脂肪,而心血管疾病的發(fā)病率和死亡率卻顯著低于歐洲其他

2、國家,這與其日常大量飲用紅酒有關(guān),紅酒中富含的白藜蘆醇(resveratrol,RSV)可能起保護(hù)作用。白藜蘆醇能夠提高沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent informationregulator1,SIRT1)酶活性并提高其乙?；孜锏挠H和力,是SIRT1的功能激活劑。而SIRT1能夠使過氧化物酶體增殖物激活受體-α(pemxisome proliferative activatedreceptor-α,PPARα)去乙酰化,PPARα

3、參與膽固醇代謝過程中的關(guān)鍵酶--膽固醇7α-羥化酶(cholesterol-7α-hydroxylase,CYP7A1)的調(diào)節(jié),進(jìn)而影響膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài),而CYP7A1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是依賴PPARa的。但SIRT1能否通過調(diào)節(jié)PPARα影響膽固醇水平,并通過上調(diào)CYP7A1的表達(dá)進(jìn)而影響脂代謝目前還未見相關(guān)報道。因此,本研究采用白藜蘆醇對高脂模型小鼠進(jìn)行干預(yù),觀察其對小鼠脂代謝的影響以及小鼠肝臟SIRT1、PPARα和CYP7A1在mRNA水

4、平的表達(dá),旨在探討白藜蘆醇對小鼠脂代謝的影響及其分子機制。
　　 材料與方法
　　 一、動物的分組
　　 50只8w齡,體重18g～22g健康雄性昆明種小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,根據(jù)體重隨機分為2組:基礎(chǔ)組(10只),高脂模型組(40只)。4w后,由內(nèi)眥靜脈采血約0.5ml,測定血清總膽固醇(Total cholesterol,TC)水平,按血清TC水平將高脂模型組隨機分為4組(每組10只):高脂組、干預(yù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

5、組。
　　 二、干預(yù)過程和樣品采集
　　 基礎(chǔ)組喂飼基礎(chǔ)飼料,高脂組和各干預(yù)組喂飼高脂飼料(其構(gòu)成為:92％的基礎(chǔ)飼料,6.75％豬油,1％膽固醇和0.25％的膽鹽)?；A(chǔ)組和高脂組給予0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；白藜蘆醇均以0.5％的羧甲基纖維素鈉溶解后分別經(jīng)灌胃給予干預(yù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組不同濃度白藜蘆醇5mg/(kg·bw·d)、22.5mg/(kg·bw·d)、45mg/(kg·bw·d)。干預(yù)6w后,小鼠禁食12

6、h,乙醚麻醉,摘眼球取血約1～2ml,離心分離血清。分離肝臟,稱重；取材制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色；檢測肝臟中SIRT1、PPARα和CYP7A1 mRNA的表達(dá)量。
　　 三、指標(biāo)分析
　　 (一)血脂的測定
　　 按試劑盒說明,采用ECOM-F6124半自動生化分析儀測定血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固(low-densi

7、ty lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。
　　 (二)氧化指標(biāo)的測定
　　 按試劑盒說明,采用Multiskan MK3酶標(biāo)儀測定血清及肝組織中丙二醛(Maleic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(G

8、lutathione peroxidase,GSH-Px)、總抗氧化能力(Totalantioxidant capacity,T-AOC)。
　　 (三)檢測各組小鼠肝臟病理改變
　　 觀察各組小鼠肝臟色澤和質(zhì)地,取部分肝組織制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色；觀察小鼠肝組織病理學(xué)改變。
　　 (四)計算肝指數(shù)
　　 肝指數(shù)(％)=肝重(g)/體重(g)×100。
　　 (五)肝臟中mRNA表達(dá)量的測定<

9、br>　　 按TRIzol說明書操作步驟,提取30～50mg小鼠肝組織的總mRNA。取總RNA1μl,按Takara RNA PCR試劑盒說明,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。取2μl cDNA為模板,以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參對照。RT-PCR各指標(biāo)反應(yīng)條件相同為:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃,2min預(yù)變性；33個循環(huán)包括:變性94℃30s、退火56℃30s、延伸72

10、℃35s。再72℃延伸10min。5μl目的基因產(chǎn)物,加預(yù)染液預(yù)染3min；2％瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析儀拍照,以與內(nèi)參對照β-actin的比值作為目的基因表達(dá)的相對含量。
　　 四、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析
　　 實驗結(jié)果用(x)±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD法,檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié) 果
　　 一、動物一般狀況及體重增量
　　 實驗期間,

11、各組小鼠一般狀況良好,生長發(fā)育未見異常表現(xiàn)。各組小鼠體重增量以干預(yù)Ⅰ組最高,但與其他各組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 二、各組小鼠肝指數(shù)
　　 各組小鼠肝指數(shù)間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 三、各組小鼠肝臟病理改變
　　 觀察各組小鼠肝臟大體標(biāo)本發(fā)現(xiàn),基礎(chǔ)組和干預(yù)Ⅰ、Ⅱ組小鼠肝臟顏色鮮紅,邊緣銳利,質(zhì)地柔軟,而高脂組和干預(yù)Ⅲ組小鼠邊緣變鈍,質(zhì)地稍硬,切面呈油膩感。由各組

12、小鼠肝臟病理切片可見,基礎(chǔ)組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常,幾乎沒有脂肪變性；高脂組小鼠的肝臟中均有部分肝細(xì)胞發(fā)生了脂肪變,但尚未達(dá)到脂肪肝的程度。各干預(yù)組的小鼠肝臟中僅有少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生了脂肪變。
　　 四、各組小鼠血脂水平
　　 比較各組小鼠TC、LDL-C水平,高脂組與基礎(chǔ)組的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),LDL水平上,干預(yù)Ⅱ組與高脂組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各干預(yù)組TG水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05

13、)；各組HDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 五、各組小鼠抗氧化水平
　　 1、血清抗氧化水平
　　 各組小鼠血清MDA,SOD,GSH-Px和T-AOC水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2、組織抗氧化水平
　　 比較各組小鼠MDA水平,以高脂組最高,其差異與其他各組均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組SOD,GSH-PX,T-AOC水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.0

14、5)。
　　 六、各組小鼠肝臟中SIRT1、PPARα和CYP7A1 mRNA的相對表達(dá)量
　　 各組小鼠SIRT1、PPARα和CYP7A1 mRNA相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、不同劑量白藜蘆醇均有降低高脂模型小鼠血清TC和LDL-C水平的趨勢,且干預(yù)Ⅱ組能明顯降低LDL-C水平。
　　 2、不同劑量白藜蘆醇均有升高高脂模型小鼠血清SOD水平的趨勢,并能