抗體分子改造

1、,隨著分子遺傳學、生物化學、特別是分子生物學的發(fā)展，人們開始著手利用DNA分子重組技術，改造和生產(chǎn)所需要的特異性單鏈抗體、免疫粘連素、超變區(qū)多肽，直到用絲狀噬菌體表面呈現(xiàn)技術構建和篩選抗體基因文庫。,一、雙特異性抗體,免疫球蛋白分子具有重鏈、輕鏈組成的4條肽鏈結構，它們共同組成2個抗原結合點。由于2個結合點的抗原特異性相同，故表現(xiàn)為單一特異性。,,雙特異性抗體是將2個結合點表現(xiàn)為不同的特異性，抗體的一個結合點的特異性表現(xiàn)為靶細胞（如腫瘤

2、細胞）結合，另一結合點可與藥物（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細胞毒性細胞）結合。,,,,這種雙特異性的結合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶細胞，提高了療效，從而可相對地減少對患者的副作用。,制備雙特異性抗體的方法主要有3種方法：,（1）雜化雜交瘤技術：將具有某種特異性（如抗瘤細胞）的Mab細胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾細胞進行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細胞株的二價瘤體。,它們分泌的是重鏈、輕鏈被雜化的抗體分子，有10種形式：

3、 重鏈、輕鏈都無改變，保持原特異性的配對抗體分子： LH-HL，KG-GK 重鏈特異性相同的配對抗體分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重鏈、輕鏈特異性不同的配對抗體分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK,,在

4、這些雜化抗體分子中，只有LH-GK配對的才是所需的雙功能抗體分子。,,（2）化學交聯(lián)法：Nisonoff和Rivers最早從事這方面的研究?；瘜W交聯(lián)的方法無需經(jīng)過細胞融合，所以比較簡便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結合在一起?；蛴秒p功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個抗體半分子交聯(lián)在一起。,,,,用于制備雙功能抗體的Mab可以是完整分子，也可是經(jīng)胃酶水解獲得F（abˊ）2片段。后

5、者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。,,（3）利用基因工程技術將兩套重輕鏈基因導入骨髓瘤細胞或傳染瘤細胞中。 這種方法制備的雙功能抗體可選擇合適的穩(wěn)定區(qū)和合適的類及亞類，而得到較好的產(chǎn)量較高的雙功能抗體。由于只有較少的嵌合導入并整合到宿主基因組，故傳染瘤細胞更為穩(wěn)定，染色體不易丟失,二、嵌合抗體,在腫瘤治療中，帶有抗瘤藥物或同位素等的抗體具有導向作用，從而可定位診斷或定向殺傷腫瘤細胞。 為解決鼠源免疫Mab免疫原性

6、這一難題，人們又設計了小鼠-人工嵌合抗體（chimerie antibody）的新型抗體。,,其原理是取某一Mab基因的V區(qū)，與人Ig基因的C區(qū)連接，然后插入到表達質粒中，傳染骨髓瘤細胞即產(chǎn)生出鼠-人嵌合抗體。 由于Ig的C區(qū)是人源的，這種抗體對人的免疫性就大為降低，采用不亞類的人C區(qū)基因，便可改變抗體的效應功能，以獲抗腫瘤的最佳效果。,,鼠-人嵌合抗體并不能徹底清除鼠源免疫原性，于是進一步提出重構抗體的設想。 即：

7、人化抗體,三、人化抗體,抗體的抗原結合區(qū)域（V）與空間結構主要由抗體V區(qū)中3個CDRS（互補決定區(qū)）所決定，所以這一抗體的構建是用原鼠IgV區(qū)中的CDR區(qū)插入到人IgV的框架區(qū)。,,這樣構建成的重組分子既保留了結合抗原的功能，又消除了鼠源的免疫原性。這類人化抗體（humanhized antibodies）也可稱為重構抗體。,,為了構建這類抗體，首先需要測出MabV區(qū)的核苷酸序列，根據(jù)其中的CDRS序列，用全合成或點突變的方法將人Ig重

8、構成MabV區(qū)的CDRS序列，然后將這種重構的V區(qū)基因與人IgC區(qū)基因連接，構成完整的人Ig基因，再于骨髓瘤細胞內(nèi)表達。,四、單鏈抗體,用一編碼親水易折疊多肽的人工合成寡核苷酸，將重鏈V區(qū)（3ˊ）與輕鏈V區(qū)（5ˊ）端連接在一起（VH-linker-VL）即成單鏈抗體基因，將此基因克隆入原核或真核表達載體中，在原核或真核系統(tǒng)中表達出的蛋白質即為單鏈抗體（single chain antibodies）。 它能自發(fā)折疊成天然構象，

9、與抗原的結合力維持與原來完整抗體一樣。,五、免疫粘連素,把細胞受體或細胞間粘附分子（intercellular adhesion molcule, ICAM）與Ig的Fc段相連，即為免疫粘連素（immunoadhesin）。,,Staunton等制成一種含有可溶性細胞內(nèi)粘附分子-1（1CAM-1）的免疫粘連素，它能有效地和特異的抑制被惡性瘧原蟲感染的紅細胞對能產(chǎn)生1CAM-1表面的粘附。當被感染的紅細胞與上述免疫粘連素結合后，F(xiàn)c片段可

10、促使單核細胞的吞噬作用。 這種抗體可用于惡性瘧疾的治療。,,T細胞表面抗原CD4是愛滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的受體，在免疫預防和免疫治療方面，免疫粘連素可能會提供一個新的途徑。,,將Ig的Fc段與CD4形成的重組分子，可以中和HIV，但只是簡單地結合會引起具Fc受體細胞的感染，而在體內(nèi)具有Fc受體的細胞相應是多的，為此只有用定點突變或其他方法改變Fc段，使之不與Fc受體結合，

11、便可有效地防治愛滋病。,六、抗體基因文庫的構建和基因表達篩選的表面呈現(xiàn)技術,1985年Smith將一基因片段克隆到載體噬菌體fd-tet的基因Ⅲ（g3）上，發(fā)現(xiàn)該基因所表達的蛋白與噬菌體基因Ⅲ表達的蛋白結合在一起呈現(xiàn)到噬菌體表面。這種表達的融合蛋白仍保留抗原特異性和生物活性，可通過相應抗原進行檢測。,,這樣我們不僅可以利用噬菌體來構建基因文庫，而且可以獲得表達性的基因文庫，無疑對高效率地篩選和富集目的基因提供了極大的方便。 現(xiàn)在這一技

12、術已被廣泛地用于抗體基因文庫，cDNA文庫、隨機多肽基因文庫和突變基因文庫的構建和篩選等諸多方面。,,絲狀噬菌體表面呈現(xiàn)技術以絲狀噬菌體為表達載體，目的基因插入到噬菌體外殼蛋白基因內(nèi)，其天達產(chǎn)物呈現(xiàn)在噬菌體表面。,Ff絲狀噬菌體,Ff絲狀噬菌體呈柔性長絲狀，直徑約為6.5nm,野生型體長約為900nm。其基因組是一單鏈環(huán)狀DNA，全序列已經(jīng)測也，約含6000多個核苷酸，編碼10種蛋白質。其中有5種蛋白組成外殼蛋白，基因Ⅷ（g8）在野生型

13、噬菌體中約有2700～3000個考貝，它所編碼的gp8蛋白是外殼蛋白的主要成分。它圍繞基因組DNA以螺旋對稱的排列構成圓管形的噬菌體外殼。除gp8外，不有4種少量的外殼蛋白：gp3、gp6、gp7和gp9，分別由基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ編碼，它們各有5個拷貝。,,目的基因表達的蛋白如若想在噬菌體表面呈現(xiàn)，就必須插在這5種外殼的其中這一處。實驗表明，在gp6、gp7、gp9中插入外源蛋白，都會影響其構成外殼蛋白的功能，而在gp8和gp3的N端插

14、入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌體表面呈現(xiàn)，也不影響噬菌體的完整性和穩(wěn)定性。,成熟的gp8含有50個氨基酸，從構成外殼的功能來看可分為4個部分：（1）C端15個氨基酸偏堿性，與DNA相結合，構成外殼的內(nèi)壁，在此處的突變將影響與DNA的相互作用。（2）25～35位肽段具有高度的疏水性，借此特性分子間相互聚合，形成固牢的外殼。這段肽鏈的改變將會影響噬菌體結構的穩(wěn)定性。（3）從第6位的脯氨酸到C末端是連續(xù)的α螺旋結構，6～24位的

15、螺旋肽段外露，在外殼上排列緊密，占據(jù)了噬菌體的大部分表面。如有稍大肽段插入，將會影響外殼的穩(wěn)定性。（4）N端1～5位的氨基酸序列是丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-門冬氨酸-門冬氨酸（A-E-G-D-D），它外露于噬菌體表面，是外源肽段插入的最佳位置。,,,,利用這一系統(tǒng)可以構建表達性基因文庫，稱為噬菌體呈現(xiàn)文庫。它最先被用于抗體基因文庫的構建和篩選。雖然利用動物的免疫可以獲得循環(huán)多克隆抗體，用細胞融合方法可以獲得單克隆抗體，但利用基因工程的技

16、術構建抗體基因庫，再篩選所需的特異性抗生，不僅擺脫了繁重的工作量，也可獲得大量的、穩(wěn)定的抗體。而且隨著研究的不斷深入和發(fā)展，抗體的多樣性，親和力也大有提高。,在構建噬菌體呈現(xiàn)抗體文庫技術中，主要有3個特點：（1）可用抗原制備出免疫吸附劑，將文庫的噬菌體與其反應，再經(jīng)洗滌、洗脫得以捕獲和純化，將這種表達所需的特異性抗體的噬菌體感染大腸桿菌而得到繁殖。如此經(jīng)過親和結合→洗滌→洗脫→繁殖的富集過程，稱為“panning”（淘選），一輪pan

17、ing便可富集1000倍。如此簡便、高效率，是其他方法比似的。,,（2）親和力成熟過程可由體內(nèi)轉為體外。如前所述，抗原物質對動物機體的再次免疫，可獲得高親和力的抗體。這種在體內(nèi)出現(xiàn)的親和力成熟的現(xiàn)象，是由于細胞抗體基因在CDRS區(qū)域突變，再通過表面呈現(xiàn)技術加篩選，便可獲得親和力的特異抗體,（3）這種方法不僅可以獲得單鏈抗體，也可制備出重鏈、輕鏈結合的抗體（Fab）片段。 外源基因編碼的肽段在融合蛋白的N端，呈現(xiàn)在噬菌體表面時，