聯(lián)合應用MALDI-TOFMS抗原表位確定技術(shù)與分子對接進行抗體人源化改造.pdf

1、眾所周知,腫瘤是最致命的疾病之一。自20世紀70年代以來,我國癌癥患者的人數(shù)逐年升高,約有百分之八十的癌癥患者死于肺癌、肝癌、胃癌等常見腫瘤。通常的治療方法包括外科手術(shù)、放射治療、化療、生物治療等,這些治療方法有時單獨使用,有時聯(lián)合使用?？贵w治療是生物治療的一種,它的重要性越發(fā)明顯。抗體治療的前景是光明的,目前已批準20余種抗體藥物用于治療各種疾病,在臨床上已取得預期效果?？贵w藥物是利用以細胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制

2、備的藥物,但由于其伴隨的人抗鼠抗體反應(HAMA),抗體藥物的應用往往受到了一定程度的限制。為了降低抗體藥物的HAMA反應,基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息發(fā)展了一系列的改造抗體的方法。隨著分子生物學的發(fā)展,嵌合抗體和人源化抗體的出現(xiàn),成為了解決抗體應用中降低HAMA反應的有效途徑,但改造的抗體往往伴隨著親和力的大幅下降。
　　本研究建立了一種新型的抗體人源化方法,首次聯(lián)合基于質(zhì)譜的表位確定技術(shù)和分子對接對抗體進行人源化改造。通過鑒定出HAb1

3、8G/CD147的抗原表位進行HAb18抗體的人源化設(shè)計,這樣就在保證了抗體HAb18親和力的基礎(chǔ)上進行人源化改造,之后通過基因重組技術(shù)合成新的抗體片段并檢測該抗體片段的生物學活性,下面將從以下三部分分別說明。
　　第一部分:MALDI-TOF MS確定HAb18G/CD147的抗原表位
　　目的:確定HAb18G/CD147的表位序列。
　　方法:利用配套的磁架洗滌新的磁珠,洗去磁珠上的防腐劑。加入適量的HAb18抗

4、體,在室溫的條件下與磁珠結(jié)合1~2小時并輕微搖晃,使抗體與磁珠充分結(jié)合。之后用PBS(0.1％ BSA,pH=7.4)洗滌磁珠4~5次,以封閉未結(jié)合抗體磁珠的活性位點。將適量的HAb18G/CD147加入到制備好的抗體磁珠混懸液中,室溫下結(jié)合1~2小時,使抗原與抗體充分結(jié)合。加入胰酶溶液酶解HAb18G/CD147,用PBS洗滌掉未結(jié)合的抗原肽段,并用0.1﹪TFA(pH=2.5)洗脫HAb18G/CD147抗原表位肽并迅速凍干,用MA

5、LDI-TOF MS檢測制備的樣品。
　　結(jié)果:制備了HAb18G/CD147抗原表位肽,說明了利用免疫磁珠酶解抗原的辦法是可行的,并且制備出的樣品符合MALDI-TOF MS檢測的標準。對制備的HAb18G/CD147抗原表位肽進行MALDI-TOF MS分析,并與PeptideCutter軟件預測的胰酶酶切HAb18G/CD147各肽段分子量進行對比,得到了HAb18G/CD147抗原表位肽的序列信息。
　　第二部分:應

6、用確定的表位與分子對接對抗體HAb18人源化設(shè)計
　　目的:確定突變的氨基酸位點。
　　方法:根據(jù)已有的HAb18抗體模型和得到的HAb18G/CD147抗原表位序列,應用DOCKING軟件建立HAb18G/CD147與HAb18的分子對接模型,并預測表位的關(guān)鍵氨基酸殘基。在模擬出HAb18G/CD147同其抗體HAb18的對接模型后,用表面重塑的方法對HAb18可變區(qū)進行人源化設(shè)計。利用序列分析和結(jié)構(gòu)分析確定鼠源抗體外露的

7、差異殘基,選定將要突變的氨基酸殘基位點,以便能夠合成低免疫原性又具有抗原結(jié)合活性的人源化抗體。
　　結(jié)果:建立了一套新的人源化抗體的方法,首次將基于MALDI-TOF MS確定抗原表位技術(shù)引入到分子對接中,建立了HAb18G/CD147和HAb18的分子對接模型,完成了HAb18可變區(qū)的人源化設(shè)計,確定突變的氨基酸位點為H42E,H90A和L43S。
　　第三部分:人源化抗體片段HAb18-huscFv的表達與鑒定
　

8、　目的:驗證該人源化方法。
　　方法:根據(jù)設(shè)計的人源化方案,用overlapping PCR的方法合成人源化形式HAb18-huscFv的基因,克隆至表達載體pCANTAB-6His-HAb18-huscFv中,轉(zhuǎn)化至E. coli中誘導表達。經(jīng)Ni2+柱純化表達的蛋白后,采用SDS-PAGE、Western blot、細胞免疫熒光等方法對表達產(chǎn)物進行檢測、鑒定,同步構(gòu)建表達其親代鼠源形式抗體為對照。采用間接競爭ELISA法分析抗

9、體HAb18-huscFv與HAb18G/CD147的結(jié)合活性, SPR法測定抗體HAb18-huscFv與HAb18G/CD147的親和力,并用同步表達的鼠源形式抗體作為對照,分析兩種抗體有無差異。最后采用HAMA陽性血清,對比了HAb18-huscFv和鼠源HAb18-scFv的免疫原性差異。
　　結(jié)果:根據(jù)已選擇的突變位點,用overlapping PCR的方法合成了新的基因并克隆至表達載體,測序驗證正確后轉(zhuǎn)化到E. col

10、i中誘導表達,經(jīng)Ni2+柱純化后獲得了較純的HAb18-huscFv。SDS-PAGE和Western blot檢測目標蛋白分子量約為27kDa。經(jīng)SPR法測定,HAb18-huscFv與HAb18-scFv相比親和力無明顯差異。用細胞免疫熒光法檢測HAb18-huscFv與肝癌細胞SMMC-7721具有一定結(jié)合能力。間接競爭ELISA法結(jié)果顯示:抗體HAb18-huscFv與HAb18-scFv相比具有較低的免疫原性。
　　結(jié)論