通用有機磷農(nóng)藥抗原表位多肽、單域抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、有機磷類農(nóng)藥具有廣譜、高效的殺蟲特點，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著較為廣泛的應(yīng)用，占我國農(nóng)藥使用總量的一半以上。但有機磷類農(nóng)藥的高毒性以及環(huán)境污染與累積毒性的風險，使之成為我國危害人類健康、食品安全監(jiān)管的重要化學物質(zhì)。
　　近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，特別是多肽、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用，針對農(nóng)藥小分子制備表位多肽、抗體及抗獨特型抗體，建立無毒無害、綠色的檢測方法有了長足的發(fā)展。目前，針對農(nóng)藥的抗獨特型抗體，及利用噬菌體技術(shù)篩選毒素的抗獨

2、特型抗體，建立無毒無害的檢測方法均有報道。而針對具有累積毒性風險的有機磷農(nóng)藥的綠色檢測方法的研究較少，具有相同毒性機理的家族類農(nóng)藥的累積風險是嚴重影響人類健康的隱含問題，急需綠色的快速檢測方法。
　　本研究利用噬菌體展示技術(shù)，得到有機磷類農(nóng)藥通用結(jié)構(gòu)（BPB）的多肽，使其模擬BPB的抗原表位，建立了針對有機磷類農(nóng)藥的無毒ELISA檢測方法，同時利用人源單域抗體庫技術(shù)，對廣譜識別有機磷農(nóng)藥的抗體進行了篩選；本文主要研究內(nèi)容：

3、　　1.抗原與抗體的制備及鑒定?？贵w材料為兩株能夠識別8-15種有機磷農(nóng)藥的廣譜型小鼠單克隆抗體細胞株，分別為BPB-BSA（牛血清蛋白）單抗細胞株及BPB-KLH（匙孔血藍蛋白）單抗細胞株。對其進行細胞的復(fù)蘇、細胞株的擴大培養(yǎng)以及細胞制備腹水。經(jīng)過辛酸-硫酸銨法初步純化后，用Protean G柱純化，SDS-PAGE估計抗體純度。結(jié)果證明純化效果明顯，間接競爭 ELISA表明抗體靈敏度與活性均較好。抗原材料為 BPB偶聯(lián)的氨基化磁珠以

4、及前人偶聯(lián)鑒定完成的抗原BPB-BSA。
　　2.利用噬菌體展示十二肽庫篩選識別及模擬抗原表位多肽。本研究完成了抗原BPB-BSA淘選有機磷類農(nóng)藥特異性識別多肽、BPB-BSA單抗淘選模擬抗原表位多肽以及BPB-KLH單抗淘選模擬抗原表位多肽。研究進行了一系列噬菌體擴增、純化和ELISA鑒定步驟，最終在BPB-KLH單抗淘選模擬抗原表位多肽研究中成功得到五株陽性克隆。結(jié)果表明，陽性噬菌體克隆多肽氨基酸序列為HPAPDHSSQSHQ

5、。氨基酸序列模擬BPB抗原表位，位于外源片段N端第3-10個氨基酸區(qū)域的抗原指數(shù)最高，可形成?轉(zhuǎn)角，其表面可及性指數(shù)和親水性指數(shù)均大于零，氨基酸的抗原表位極有可能在此區(qū)間。
　　3.利用單域抗體庫篩選抗獨特型抗體和特異性識別抗體。完成BPB偶聯(lián)氨基化磁珠淘選單域抗體和BPB-KLH單抗淘選抗獨特型抗體，實驗均能夠篩選到特異性結(jié)合靶分子的噬菌體，但均沒有競爭效果，有待進一步的研究。
　　4.基于BPB-KLH單抗淘選模擬抗原表