齒蘭環(huán)斑病毒抗原表位的鑒定及其在抗體純化中的應用研究.pdf

1、學校代碼：10385分類號：研究生學號：1301415003密級：齒蘭環(huán)斑病毒抗原表位的鑒定及其齒蘭環(huán)斑病毒抗原表位的鑒定及其在抗體純化中的在抗體純化中的應用研究應用研究EpitopemapingofOdontoglossumRingspotViruscoatproteinapplicationfpurificationofspecificantibody作者姓名：鄭國華鄭國華指導教師：林毅林毅教授教授實踐導師：明艷林明艷林研究員研究員

2、專業(yè)學位類別領域：生物工程生物工程研究方向：基因基因工程工程所在學院：化工學院化工學院論文提交日期：二零一七年五月九日摘要III摘要齒蘭環(huán)斑病毒(OdontoglossumringspotvirusSV)屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），是導致蘭花失去經(jīng)濟價值和觀賞價值的主要病毒之一。近年來，由于國際市場對SV有較高的檢疫要求，蘭花種苗生產(chǎn)企業(yè)及進出口檢疫部門對該病毒檢測產(chǎn)品有較大需求。但是，由于SV與同屬病毒存在明顯血清學

3、交叉反應，導致使用多克隆抗體的檢測產(chǎn)品準確性較差，無法滿足市場需求。本文為提高檢測產(chǎn)品的準確性，首先使用SV多克隆抗體（SVPAbs）對噬菌體展示7肽庫進行淘洗富集；采用高通量測序技術測定噬菌體展示多肽的基因序列，得到4681條序列，其中有58條推導的氨基酸序列與SV高度同源，主要分布在1~35aa、43~68aa、107~153aa；同時結合位點保守性，初步表明SV的特異抗原表位位于：2SYTITDPSKLAYLSSAWADPNSLI

4、NLCTN30、50ADVWQPVPTLTSRFPAGAGYFR71、141MYNQVSFETMSGLTWTSS158。進一步利用原核表達得到15個C端攜帶SVCP多肽片段的融合蛋白；采用ELISA測定這些融合蛋白與SVPAbs的親和特異性，發(fā)現(xiàn)攜帶SVCP130aa區(qū)域短肽的融合蛋白（共5個）以及5675aa區(qū)域的融合蛋白（共4個）均與SVPAbs存在明顯親和反應。因此，本研究明確了SVCP特異性的抗原表位為：2SYTITDPSKLA

5、YLSSAWADPNSLINL27、56VPTLTSRFPAGAGYFR71。最后，本研究通過化學合成得到SV1（2SYTITDPSKLAY13）、SV2（15SSAWADPNSLINL27）、SV3（58TLTSRFPAGAGYFR71）3個多肽，并作為配基分別偶聯(lián)到CNBr活化瓊脂糖凝膠FF制備得到3種親和介質；利用這些親和介質從SVPAbs中純化得到3個多肽抗體AntiSV1、AntiSV2、AntiSV3；經(jīng)ELISA測定表明，