抗炭疽人源化抗體的研究.pdf

1、炭疽是由炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)引起的人畜共患的重大烈性傳染病。炭疽芽孢作為A類生物戰(zhàn)劑,由于其強(qiáng)烈的致病力及其對(duì)環(huán)境的極強(qiáng)適應(yīng)能力等特性,一直是生物戰(zhàn)/生物恐怖的首選,也是重大的威脅。因此,炭疽防控是防生/反恐的重要研究目標(biāo)。對(duì)于炭疽有效的治療措施主要有二大類:一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑,其中包括抗菌素和噬菌體的溶菌成分;另一類是依據(jù)炭疽病理模型設(shè)計(jì)的毒素抑制劑,主要包括炭疽毒素中和抗體、可溶性受體、毒

2、素突變體和小分子拮抗劑。對(duì)吸入性炭疽的治療抗菌素雖然有效,但必須在感染初期立即使用,存在一定的缺陷。具有中和活性的抗體作為被動(dòng)免疫制劑可以直接提供有效的保護(hù),其因?yàn)榫哂斜Ｗo(hù)性高,在人體內(nèi)可以發(fā)揮特有的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(complement dependent cytotoxicity,CDC)和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)免疫反應(yīng),半衰期

3、長(zhǎng),性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),成為目前最有前景的炭疽毒素抑制劑。
　　本研究的目標(biāo)是基于國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和研究室的基礎(chǔ),期望研制新型炭疽特異性治療藥物。研究?jī)?nèi)容包括首先對(duì)抗PA鼠源單抗進(jìn)行人源化改造以降低鼠單抗的異源性,然后利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)規(guī)模化制備人源化抗體,并對(duì)純化的人源化抗體進(jìn)行體內(nèi)外效力學(xué)研究。
　　首先應(yīng)用抗體“框架區(qū)重塑”技術(shù),對(duì)本室制備并保存的鼠源單克隆抗

4、體(mAb)的框架區(qū)進(jìn)行了人源化。通過Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的鼠源單抗進(jìn)行框架區(qū)(framework region, FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determinative region, CDR)的劃分。保持CDR區(qū)氨基酸不變,對(duì)FR序列進(jìn)行最大同源性檢索,選擇與框架區(qū)同源性最高的人源序列。考慮到CDR相鄰的3個(gè)氨基酸可能對(duì)構(gòu)象有影響,對(duì)個(gè)別關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了保留。人源化程度分別達(dá)到了95.35％和95.77％(

5、氨基酸序列的同源性)。然后構(gòu)建了帶His標(biāo)簽的人源化單鏈抗體的原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達(dá)了人源化單鏈抗體,亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在,超聲后的包涵體經(jīng)洗滌、變性后經(jīng)過Ni離子螯合柱純化,ScFv純度達(dá)90％以上。經(jīng)梯度透析法復(fù)性得到了人源化的單鏈抗體,并在毒素作用的J774A.1細(xì)胞模型上對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)證明人源化單鏈抗體具有一定的中和活性,為進(jìn)一步制備具有生物學(xué)功能的全分子人源化抗體奠定了

6、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本文選擇利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備人源化全分子抗體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)具有天然活性蛋白的最佳宿主,有很多其他體系不能與之相比的優(yōu)勢(shì)。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的完整抗體和天然抗體一樣,具有生物學(xué)活性,既可識(shí)別抗原又可激活補(bǔ)體系統(tǒng)。目前,美國(guó)418種在研藥物中70％是由以CHO為主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的。
　　為了獲得在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)的工程細(xì)胞株,我們嘗試了不同的信號(hào)肽及細(xì)胞系,分別構(gòu)建了四種信號(hào)肽的表達(dá)質(zhì)

7、粒包括 pMH3-EPO-HII/L、pMH3-tPA-HII/L、pMH3-ori-HII/L和pMH3-VH21-HII/L。將表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染CHO-S及CHO-K1細(xì)胞,并用G418進(jìn)行篩選,G418濃度為1.8mg/ml。一次克隆所得到的穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株經(jīng)過二次克隆篩選,最終發(fā)現(xiàn)pMH3-VH21-HII/LII在CHO-S細(xì)胞中的表達(dá)量較高,挑選高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng),最終得到可穩(wěn)定傳代的高表達(dá)細(xì)胞株。將得到的細(xì)胞株用無

8、血清培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng),并逐級(jí)放大,最終在CURRENT AP200生物反應(yīng)器中進(jìn)行規(guī)?；苽?發(fā)酵過程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、葡萄糖濃度、滲透壓、pH值和溶氧情況等指標(biāo),優(yōu)化培養(yǎng)條件,最終可以達(dá)到高于300mg/L的產(chǎn)量,反應(yīng)器中的細(xì)胞產(chǎn)率達(dá)到7.87pg/cell/day。62L的發(fā)酵液經(jīng)過離心、超濾濃縮后用Mab select sure親和層析介質(zhì)進(jìn)行純化,最終可以得到13g以上的純品,HPLC測(cè)定抗體的純度大于95％,得率大于

9、60％。
　　表達(dá)的全分子人源化抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約150kD的帶,在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶;Dot-Blot結(jié)果顯示,此人源化抗體可以與PA的結(jié)構(gòu)域2(非loop區(qū))發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。N末端氨基酸序列測(cè)定和分子量測(cè)定顯示獲得預(yù)期的人源化抗體。
　　在獲得預(yù)期的人源化抗體后,在體內(nèi)外模型上進(jìn)行了效力學(xué)研究。在毒素作用的J774A.1細(xì)胞模型上,人源化抗體顯示良好

10、的保護(hù)活性,EC50為0.95μg/ml。在毒素作用的Fisher344大鼠模型上,如果毒素和抗體同時(shí)給藥,抗體和PA摩爾比為1:1時(shí)即可提供完全保護(hù);抗體在毒素之后10min給藥,抗體與PA摩爾比為8:1即抗體給藥量為3.2mg/kg時(shí),保護(hù)率達(dá)83.3％(5/6),而抗體在毒素之后20min和30min給藥,即使抗體量達(dá)到8mg/kg和32mg/kg,依然不能使大鼠存活,但可以延長(zhǎng)大鼠的存活時(shí)間。在芽孢感染的家兔模型上,采用攻毒菌株