抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用

1、第七章 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用,第三節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用,2024/3/11,第三節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用,一、免疫沉淀和免疫凝集二、免疫標(biāo)記三、免疫定位分析四、抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用,2024/3/11,一、免疫沉淀和免疫凝集,免疫沉淀和免疫凝集利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對(duì)抗原或抗體進(jìn)行量或質(zhì)的測(cè)定分析，是最經(jīng)典的血清學(xué)方法。 特點(diǎn)：特異、靈敏、快速。,2024/3/11,,溶液中的沉淀反應(yīng)在體外可溶性抗原與

2、相應(yīng)抗體形成肉眼看見(jiàn)的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于觀察。,2024/3/11,,,環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)示意圖,2024/3/11,,2、凝膠中沉淀反應(yīng)抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)?？乖肿优c抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散，相遇形成沉淀。以瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)較為常用。單向免疫擴(kuò)散：抗體混于瓊脂中，小孔中加入抗原，抗原向周?chē)鶆驍U(kuò)散，與抗體形成沉淀環(huán)。可用于定量測(cè)定免疫球蛋白和

3、補(bǔ)體的含量等。雙向免疫擴(kuò)散：抗原和抗體向周?chē)鷶U(kuò)散后可在兩孔之間形成白色沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測(cè)。缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低。,2024/3/11,,,免疫雙擴(kuò)散,2024/3/11,,3、電泳條件下的沉淀反應(yīng) a、免疫電泳： 是利用蛋白質(zhì)在凝膠中遷移率不同1能被分離的特性與免疫擴(kuò)散結(jié)合進(jìn)行分析的方法，這種方法能提高分辨率和靈敏度。 實(shí)驗(yàn)分二步,先用電泳將抗原各成分依電泳速度不同分開(kāi),再進(jìn)行雙擴(kuò)散,常用此法進(jìn)行血

4、清的蛋白種類(lèi)分析,對(duì)于免疫球蛋減少或增多的疾病診斷或鑒別診斷有重要意義。,2024/3/11,,,2024/3/11,,b、對(duì)流免疫電泳: 是一種將雙向擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方法。即在瓊脂板上, 使抗原和抗體在電場(chǎng)作用下定向移動(dòng), 當(dāng)抗原抗體相遇且二者濃度比例合適時(shí), 即可出現(xiàn)白色沉淀線。,2024/3/11,c、火箭電泳： 單行免疫擴(kuò)散與電泳結(jié)合的一種方法。在已混合有抗體的凝膠上，做一個(gè)小孔，加入抗原，電泳后，沿著電

5、泳方向形成火箭型沉淀，沉淀線的高度與抗原量成正比。,,,2024/3/11,,4、免疫凝集： 大的顆粒性抗原如細(xì)胞細(xì)菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合后能使抗原顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼可見(jiàn)的凝集小塊，即為凝集反應(yīng)。 最常見(jiàn)的凝集反應(yīng)是紅細(xì)胞凝集，即血凝反應(yīng)。 免疫凝集反應(yīng)雖然簡(jiǎn)便，但受反應(yīng)靈敏度限制，在實(shí)際應(yīng)用中越來(lái)越少。,2024/3/11,二、免疫標(biāo)記,免疫標(biāo)記技術(shù)：將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)（示蹤物），通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物反映有

6、無(wú)抗原抗體反應(yīng)，從而間接測(cè)出微量的抗原或抗體。目前有四種方法：放射免疫分析法：以同位素為示蹤物，為最靈敏、可靠的免疫標(biāo)記技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）熒光與發(fā)光免疫分析親和標(biāo)記的免疫分析,2024/3/11,,1、放射免疫分析 原理: 放射性同位素(131I, 或125I)標(biāo)記Ag或Ab測(cè)定Ab或Ag,通過(guò)測(cè)定放射活性判斷結(jié)果。該法常用于測(cè)定微量物質(zhì): 如胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)

7、gE等。檢測(cè)方法： 液相體系用液體閃爍儀計(jì)數(shù)； 固相體系用X射線膠片顯影。,2024/3/11,,,放射性同位素標(biāo)記分析法,,2024/3/11,,2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(1)定義：抗原與抗體吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原與抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標(biāo)記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物。(2) 測(cè)試方法：可目測(cè)或用分光光度計(jì)比色進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。,2

8、024/3/11,,(3)測(cè)試過(guò)程使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成） 在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）,2024/3/11,,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離） 加入底物后，底物被酶催化變?yōu)?/p>

9、有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）,2024/3/11,常用標(biāo)記的酶及其底物,2024/3/11,,3、熒光與發(fā)光免疫分析 用于標(biāo)記抗體的熒光化合物有異硫氰熒光素、羅丹明熒光素等，適用于抗原細(xì)胞與組織的定位分析。 時(shí)間分辨熒光免疫分析法： 原理：稀土銪離子Eu3+螯合物標(biāo)記抗體后，抗體與 固相抗原結(jié)合，抗體上的Eu3+在紫外光（340nm）激發(fā)下，與增強(qiáng)液中的

10、β-二酮體重新形成一種微膠體螯合物，發(fā)出長(zhǎng)壽命的高強(qiáng)度熒光（613nm），比未激發(fā)時(shí)增強(qiáng)了100萬(wàn)倍，可用時(shí)間分辯熒光計(jì)記錄。,2024/3/11,,,2024/3/11,,4、親和標(biāo)記的免疫分析 親和標(biāo)記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生物素（維生素）、地高辛（小分子藥物） 原理：金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgG的Fc有高度親和力。用酶、同位素和熒光素等標(biāo)記A蛋白，與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。,2024/3/11,三、免疫

11、定位分析,1.免疫熒光定位分析2.酶標(biāo)記免疫定位3.免疫電子顯微鏡技術(shù),2024/3/11,,1、免疫熒光定位分析 用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標(biāo)記抗體用于免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)。（熒光化合物+抗體）------生物大分子（抗原）在細(xì)胞或組織中的表達(dá)和定位熒光素：異硫氰熒光素、異硫氰四甲基羅丹明熒光顯微鏡觀測(cè)熒光激活細(xì)胞分揀器（流式細(xì)胞儀）應(yīng)用：CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)原理：流式細(xì)胞儀產(chǎn)生分析的電信

12、號(hào)生要是光散射信號(hào)和熒光信號(hào)，流式細(xì)胞儀依據(jù)細(xì)胞流經(jīng)光照射區(qū)時(shí)電壓訊號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)分析和分選細(xì)胞。,2024/3/11,,2、酶標(biāo)記免疫定位 酶標(biāo)記免疫定位的方法及原理與dot-ELISA相同，所用的酶底物在反應(yīng)后必須形成不溶于水的有色產(chǎn)物。酶標(biāo)記免疫定位主要用于免疫組織化學(xué)進(jìn)行組織和細(xì)胞內(nèi)的抗原定位，及在免疫印跡分析中代替同位素標(biāo)記進(jìn)行定位顯色等。,2024/3/11,,（1）酶標(biāo)免疫組織化學(xué)固相抗原為組織切片或細(xì)胞樣品。（2）免

13、疫印跡 蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳后，形成不同的條帶，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行顯色反應(yīng)，可確定目的蛋白的有無(wú)，或分子量大小。 分三個(gè)階段進(jìn)行 :SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）轉(zhuǎn)移——硝酸纖維素膜 酶免疫定位,2024/3/11,,,免疫印跡法原理示意圖,2024/3/11,,3、免疫電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：提高了電鏡觀察的特異性。 如形態(tài)相同，但結(jié)構(gòu)和

14、組成不同的生物粒子，細(xì)胞器或病毒粒子。種類(lèi)： 一類(lèi)是先用抗體捕捉抗原，然后用磷鎢酸負(fù)染色觀察。另一類(lèi)是用金標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位。膠體金與抗體Fc段結(jié)合。,2024/3/11,四、抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用,1、免疫親和色譜 免疫親和色譜是一種從多組分混合物中分離純化單組份產(chǎn)物簡(jiǎn)便而有效的方法，比凝膠過(guò)濾和離子交換色譜或得的產(chǎn)物純度更高。原理：任何一對(duì)抗原-抗體的組分之一與固相基質(zhì)交聯(lián)后均可用于另一組分的純化。廣泛用于蛋白質(zhì)抗原的

15、分離純化。固相基質(zhì)：瓊脂糖、葡聚糖,2024/3/11,,,,,,,OD280檢測(cè),凝膠電泳,,,,,,免疫親合色譜示意圖,2024/3/11,2、免疫生物感應(yīng)器與抗體芯片機(jī)理：抗原與抗體在相互結(jié)合后，它們的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，一些次級(jí)鍵參與結(jié)構(gòu)的變化。這種結(jié)構(gòu)的改變通過(guò)電場(chǎng)效應(yīng)的改變可以被檢測(cè)到。可以判斷抗原抗體的結(jié)合是否發(fā)生及發(fā)生的強(qiáng)度。,,,組成：a生物受體（抗體）b轉(zhuǎn)導(dǎo)體 c電子放大處理器,,謝謝觀賞,免疫學(xué)導(dǎo)論,10生物技