納米抗體N-28模擬DON抗原的分子機(jī)制研究及定點(diǎn)改造.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）主要是由禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于大麥、小麥、玉米等谷物及其制品中，嚴(yán)重危害人類及動(dòng)物的健康。DON具有急性和慢性毒性，可引起厭食、嘔吐、腹瀉和發(fā)燒等癥狀，同時(shí)還具有細(xì)胞毒性、免疫毒性等多種毒性作用。鑒于DON的巨大危害，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)建立起了多種檢測(cè)方法；其中，免疫分析法由于其簡(jiǎn)便、快速、特異性好、適合高通量檢測(cè)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

2、　　免疫學(xué)分析法基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，為提高靈敏度，最直接的方法是制備高親和力的天然或人工抗體；但該方法較為困難，且容易遇到瓶頸。另一種方法為改造抗原；針對(duì)小分子檢測(cè)，改造抗原進(jìn)行異源性分析往往能提高免疫分析方法的靈敏度。傳統(tǒng)的抗原改造是通過人工合成半抗原的結(jié)構(gòu)類似物，但該方法具有一定的盲目性，過程較復(fù)雜，且人工合成過程會(huì)對(duì)操作人員和環(huán)境帶來危害。
　　本研究以DON單克隆抗體為靶分子，從駝源天然納米抗體庫(kù)中淘選與DON單抗

3、特異結(jié)合的納米抗體，以該納米抗體作為DON抗原模擬物，替代傳統(tǒng)的人工抗原，不僅減少了人工抗原合成過程中DON的污染，而且建立了DON的異源性免疫分析方法提高了檢測(cè)靈敏度。采用分子模擬技術(shù)和丙氨酸掃描技術(shù)，構(gòu)建并驗(yàn)證了納米抗體與DON抗體的結(jié)合模型，從分子水平上揭示了納米抗體模擬DON抗原的作用機(jī)制。繼而采用定點(diǎn)飽和突變技術(shù)，對(duì)納米抗體進(jìn)行改造，獲得靈敏度提高的突變子，并以其建立免疫學(xué)檢測(cè)方法。主要研究結(jié)果如下：
　　1.基于納米抗

4、體的DON抗原模擬物的淘選
　　采用“1輪酸洗脫+3輪競(jìng)爭(zhēng)洗脫”的組合洗脫方式，經(jīng)過4輪淘選，獲得了兩個(gè)能與DON標(biāo)品特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DON單抗的噬菌體克隆，分別命名為P-28和P-31。分別建立了基于P-28和P-31的Phage-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50分別為78.89±1.77ng/mL和68.18±1.15ng/mL，線性范圍分別為21.24-316.52ng/mL和16.36-262.05ng/mL。
　　2.納

5、米抗體的表達(dá)及其在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用
　　將P-28和P-31的編碼基因克隆至pET-25b(+)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得納米抗體蛋白N-28和N-31。以N-28和N-31分別建立了ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50分別為8.77±0.4 ng/mL和19.97±0.84ng/mL，靈敏度比基于DON-BSA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線（IC50為163.69±2.68ng/mL）分

6、別提高了18倍和8倍。以N-28作為檢測(cè)抗原建立了檢測(cè)谷物中DON的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，用該方法對(duì)谷物樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與商業(yè)化ELISA試劑盒進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示兩種方法的相關(guān)性系數(shù)R2=0.997。
　　3.納米抗體N-28模擬DON抗原分子機(jī)制的研究
　　采用分子模擬技術(shù)構(gòu)建了N-28/DON與anti-DON ScFv的結(jié)合模型，比較兩個(gè)模型發(fā)現(xiàn)N-28與DON對(duì)接于ScFv的同一位點(diǎn)，N-28的CDR3區(qū)氨基酸Thr

7、102-Ser106能夠模擬DON與ScFv相互結(jié)合。隨后采用丙氨酸掃描技術(shù)驗(yàn)證了分子模擬預(yù)測(cè)的對(duì)接模型。
　　4.納米抗體N-28的定點(diǎn)改造
　　將N-28的5個(gè)關(guān)鍵氨基酸分別進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，通過Phage-ELISA和測(cè)序進(jìn)行篩選和鑒定，最終得到77個(gè)不同的突變子；其中3個(gè)突變子（N-28-T102Y、N-28-V103L和N-28-Y105F）的靈敏度與野生型N-28相比分別提高了3.2、1.5和2.2倍。以N-28