高效液相色譜法剖析

1、高效液相色譜法在藥物分析中的研究進(jìn)展,匯報(bào)人：李巧榮 2016.12.19,主要內(nèi)容 1.簡(jiǎn)介 2.高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用 3.高效液相色譜法在藥物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用 4.高效液相色譜法在藥代動(dòng)力學(xué)中的研究 5.高效液相色譜法未來(lái)的發(fā)展方向 6. 參考文獻(xiàn) 7.本綜述討論提綱,1.

2、 簡(jiǎn)介,高效液相色譜法 （HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。HPLC在國(guó)內(nèi)和國(guó)外的藥物分

3、析領(lǐng)域的應(yīng)用范圍很廣，發(fā)展速度也很快，尤其在我國(guó)，近十幾年來(lái)HPLC方法越來(lái)越受到重視。尤其在藥物分析應(yīng)用方面，高效液相色譜法有著不可替代的作用，它對(duì)于藥物的鑒別、分離、定量測(cè)定都有著較高的準(zhǔn)確度，本文對(duì)高效液相色譜法在藥物分析的各方面進(jìn)行了簡(jiǎn)單的綜述。,2. 高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用2.1 在中藥分析方面的應(yīng)用 中藥歷史悠久，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。它不僅是我國(guó)醫(yī)藥體系中獨(dú)具特色的重要組成部分，也是西方醫(yī)藥，特別是植物藥、

4、天然藥物的有機(jī)組成部分。,,,,陳靜嫻，張敏敏等建立分散固相萃取-高效液相色譜(DSPE-HPLC)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于金銀花及其相關(guān)中成藥連花清瘟膠囊(LQC)中環(huán)烯醚萜苷類成分(馬錢酸、莫諾苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、開(kāi)聯(lián)番木鱉苷二甲基乙縮醛)的快速提取、凈化和測(cè)定的方法。方法是分別采用超聲提取法對(duì)金銀花及相關(guān)中成藥LQC進(jìn)行提取,采用不同凈化材料進(jìn)行快速凈化,采用HPLC法測(cè)定環(huán)烯醚萜苷類成分。結(jié)果采用硅藻土作為凈化劑,金銀花提

5、取物凈化效果較好;采用硅藻土-活性炭(80∶20)的復(fù)合凈化劑時(shí),LQC提取物凈化效果較好;且該提取方法操作簡(jiǎn)單、快速、樣品用量少、凈化效率高,結(jié)合HPLC技術(shù)實(shí)現(xiàn)了金銀花及相關(guān)中成藥LQC中環(huán)烯醚萜苷類成分的快速提取、凈化和測(cè)定。結(jié)論是拓展了DSPE技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中藥材及中成藥中活性成分提取、凈化中的應(yīng)用,為復(fù)雜基質(zhì)中藥材及中成藥中活性成分的提取凈化及分析研究提供了方法和數(shù)據(jù)支持。,藥劑與工藝.2016.47(16):2850-285

6、6.,但由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性，中藥成分分析一直存在著分離難度大、分析時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。近年來(lái)，（UPLC）超高效液相色譜分離技術(shù)的發(fā)展與成熟有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）分析中存在的不足，使中藥化學(xué)成分分析進(jìn)入了高效、高通量的階段。,2.2 在復(fù)方制劑分析方面的應(yīng)用 復(fù)方制劑、雜質(zhì)或輔料干擾因素多的品種多采用高效液相色譜法。重要復(fù)方制劑和化學(xué)復(fù)合制劑通常含有多種有效成分，各有效成分的含量決定了藥物的治療效果。

7、高效液相色譜法適合分子量大、難氣化、對(duì)熱敏感等物質(zhì)的分離分析，因此在中藥復(fù)方制劑和化學(xué)復(fù)合制劑的分析中得到了廣泛的應(yīng)用。 瀉痢固腸片是由甘草、陳皮、肉豆蔻、白芍、黨參、茯苓等9味中藥材制成的治療腹脹腹瀉的中藥復(fù)方制劑，方中陳皮、白芍具有理氣燥濕、益氣健脾之功效，并以甘草調(diào)和諸藥，共奏健脾溫腎，澀腸止瀉之功效。齊老師等建立固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定瀉痢固腸片芍藥苷、甘草苷、陳皮苷的含量，該法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高，為

8、瀉痢固腸片的質(zhì)量控制提供重要科學(xué)依據(jù)。 西北藥學(xué)雜志，2016.27(15):2138-2140.,2.3 在手性藥物分析方面的應(yīng)用 在生物體內(nèi)，幾乎所有具有重要生理意義的有機(jī)生物分子都有手性，絕大多數(shù)都是旋光性物質(zhì)。兩種化學(xué)組成、分子式完全相同的化合物，但因組成化合物的原子在空間取向不同，而成為鏡像的化合物，稱為手性化合物。由于對(duì)映體的物理、化學(xué)性質(zhì)相同，實(shí)現(xiàn)它們的分離就比較困難，如大多數(shù)氨基酸都

9、有右旋體和左旋體，但往往只能獲得右旋體和左旋體的混合物。手性藥物往往呈現(xiàn)一種對(duì)映體具有強(qiáng)的生物活性和藥效，而另一種卻無(wú)效，有時(shí)甚至有毒害作用。目前，各種手性分析技術(shù)中，高效液相色譜法對(duì)于定量分析和制備分離都是應(yīng)用最為廣泛的一種技術(shù)。,翟明翚； 蘇立強(qiáng)等建立了以羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）作為手性流動(dòng)相添加劑,高效液相色譜拆分美索巴莫對(duì)映體的方法。在C18色譜柱上,系統(tǒng)考察了手性添加劑的種類及濃度、有機(jī)修飾劑的種類及含量、流動(dòng)相p

10、H值和流速等因素對(duì)拆分的影響,確定了最佳色譜分離條件:流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（體積比為25∶63∶12）,CM-β-CD濃度為0.6 g·L-1,pH=4.16（用三乙胺-冰乙酸調(diào)節(jié)）,流速為0.4m L·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。該方法拆分美索巴莫對(duì)映體,方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好。,新技術(shù)與應(yīng)用.2016.28(3):416-419.,2.4 在藥物鑒別方面的應(yīng)用,在HPLC法中,保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和

11、性質(zhì)有關(guān),是定性的參數(shù),可用于藥物的鑒別.如中國(guó)藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定:在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別。,3.高效液相色譜法在藥物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用3.1 中藥材指紋的建立 隨著中藥的普及，中藥材急需國(guó)際化、標(biāo)準(zhǔn)化。而中藥材的指紋圖譜研究是其標(biāo)準(zhǔn)化的必經(jīng)之路。中藥指紋

12、圖譜的建立，應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為依托，體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性三個(gè)基本原則。為此，才能保證指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、客觀化，從而便于推廣和應(yīng)用。利用HPLC技術(shù)，建立藥材或中成藥特征的色譜或光譜的圖譜是一種有效的方法。,如肖鳳艷； 張克勤等建立烏腺金絲桃高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,試驗(yàn)采用HPLC法,將樣品經(jīng)甲醇超聲提取,選用shim-pack VP-ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5

13、μm);柱溫40℃;流動(dòng)相為甲醇和6 mmol/L磷酸氫二鈉(磷酸調(diào)至p H值為6.5),梯度洗脫;分段用260 nm、324 nm、408 nm、588 nm檢測(cè);流速為0.6 mL/min的系統(tǒng)條件下進(jìn)行研究。結(jié)果表明:此種檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合要求;通過(guò)隨機(jī)對(duì)10批藥材樣品的監(jiān)測(cè)分析,建立了烏腺金絲桃中藥材的HPLC指紋圖譜,共標(biāo)定了24個(gè)共有指紋峰。說(shuō)明所用方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好,可為烏腺金絲桃中藥材的質(zhì)量控制提供參考

14、。,獸藥飼料.2016(502):169-171.,3.2 臨床治療藥物的監(jiān)測(cè) HPLC法不需要對(duì)樣品進(jìn)行高溫汽化，一般不必進(jìn)行衍生化處理；并且其固定相種類較多，流動(dòng)相通過(guò)改變其組成成分及比例，可以對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)化合物藥物進(jìn)行分離測(cè)定。因此，HPLC法是一種比較成熟的，臨床藥物監(jiān)測(cè)方法。,莊奕筠； 張吟等建立超高效液相色譜法測(cè)定人血清中卡馬西平(CBZ)、苯妥英鈉(PHT)、苯巴比妥(PB)、奧卡西平(OXC)活性代謝產(chǎn)物利

15、卡西平(MHD)的濃度。方法于2014年1月2015年6月收集血清樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后直接進(jìn)樣測(cè)定,采用Shim-pack XR-ODSⅢ柱(1.6μm,75 L×2.0)。流動(dòng)相為甲醇-水,采用梯度洗脫程序;掃描波長(zhǎng)200～360 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,流速:0.4 m L/min,柱溫:35℃,進(jìn)樣體積:10μL。結(jié)果 CBZ、PHT、PB、MHD均能達(dá)到良好分離,與相鄰峰的分離度(R)均>1.5;線性范圍分

16、別為(1.00～ 32.00)μg/mL(r=0.9997)、(2.55～81.60)μ g/mL(r=0.9997)、(2.35～75.20)μg/mL(r=0.9999)、(2.50～80.00)μg/m L(r=0.9998);方法回收率>97%;日內(nèi)和日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均<1.6%。結(jié)論超高效液相色譜法(UPLC)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,適用于臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。,藥物研究.2016.54(12):105-1

17、11.,4.高效液相色譜法在藥代動(dòng)力學(xué)中的研究 HPLC能同時(shí)進(jìn)行分離和定量測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)在治療藥物檢測(cè)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)中體現(xiàn)地尤為突出。為了達(dá)到藥品應(yīng)用的安全、有效、可靠，這就需要了解和研究藥物及其制劑在體內(nèi)的過(guò)程（吸收、分布、代謝、排泄），以便研究藥物的作用機(jī)制及藥效學(xué)。同時(shí)隨著藥物分析技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，可對(duì)人體和動(dòng)物體內(nèi)（體液、組織和血中）藥物及其代謝物的濃度進(jìn)行定量分析，它對(duì)藥品的評(píng)價(jià)、指導(dǎo)臨床合理用藥和藥代動(dòng)力學(xué)研

18、究均具有重要的意義和現(xiàn)實(shí)需要。,馮素香等建立蘆薈大黃素在大鼠血漿中的固相萃取-高效液相色譜分析方法,研究大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。SD大鼠,按50和20mg.kg-1劑量灌胃給藥,不同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈取血,以SPE處理血漿樣品,用HPLC內(nèi)標(biāo)法測(cè)定血藥濃度,甲醇-0.1%磷酸水(70∶30)為流動(dòng)相,柱溫為30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,以DAS2.0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果:血漿中蘆薈大黃素在0.016～19.53μg.mL-1(r=0

19、.998 1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,提取回收率為88.7%～94.6%,最低檢測(cè)限為0.008μg.mL-1,定量限為0.016μg.mL-1,日內(nèi)和日間精密度RSD均<6%.建立的測(cè)定大鼠體內(nèi)蘆薈大黃素含量的方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度以及專屬性,適用于蘆薈大黃素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。,中國(guó)新藥雜志，2012.21(8):908-911.,5.高效液相色譜法未來(lái)的發(fā)展方向 高效液相色譜法在現(xiàn)在分離中發(fā)揮著重要的作用

20、，已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，在今后的研究中，高效液相色譜仍然會(huì)在藥物分析中扮演非常重要的角色，高效液相色譜法今后在以下三個(gè)方面著重發(fā)展。 縮短分析時(shí)間,提高分離效率 進(jìn)一步向自動(dòng)化、智能化及聯(lián)用技術(shù)上發(fā)展 高效液相色譜在中藥分析中的發(fā)展,,,,[1]王靜，魏娜，等.HPLC、UPLC測(cè)定芪參益氣滴丸中5個(gè)丹參活性成分含量的比較研究[J].藥物分析雜志2011.31(9):1678-168

21、2.[2]楊水艷,謝笑天,葉青松，等.鉑類抗癌配合物的高效液相色譜法研究進(jìn)展. 貴金屬，2011.32(3):90-95.[3]馮素香,徐會(huì)平,等.大鼠血漿中蘆薈大黃素濃度的固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)新藥雜志，2012.21(8):908-911.[4] 齊廣才,吳江瑞,等.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定瀉痢固腸片中芍藥苷、甘草苷、橙皮苷的含量[J].中南藥學(xué)，2016.04：418-421

22、.[5]齊廣才,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方消痔栓中3種成分的含[J].西北藥學(xué)雜志，2016.27(15):2138-2140.[6]肖鳳艷等.烏腺金絲桃HPLC指紋圖譜初步研究[J].獸藥飼料.2016(502):169-171.[7] 邵林，郭慶梅，等.山東不同栽培品種金銀花HPLC指紋圖譜的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011.17(19):117-121. [8] 王轉(zhuǎn),尹東東,等.高效液相色譜法在手性藥物分析中的研