高效液相色譜法應(yīng)用中常見問題與處理

1、1高效液相色譜法應(yīng)用中常見問題與處理lionguy（呼和浩特010010；）[摘要]對高效液相色譜法應(yīng)用過程中常見的問題及其處理方法進(jìn)行了闡述。[關(guān)鍵詞]液相色譜法，問題及處理1.對流動相的要求對流動相的要求1.1應(yīng)使用色譜純的液體試劑配制流動相，固體試劑至少使用優(yōu)級純。流動相配制后應(yīng)立即使用，時(shí)間久了(超過2天)，不宜再用；特別是加有緩沖鹽的流動相，過久的貯存會導(dǎo)致其內(nèi)部生長肉眼看不見的細(xì)菌，若仍然使用它，大量的菌絲體就會附著在色譜柱

2、內(nèi)，將大大縮短色譜柱的使用壽命。1.2高純水也應(yīng)該使用新鮮制備的，否則回出現(xiàn)與1.1同樣的問題。高純水是將飲用水經(jīng)過二次處理(其中至少一次是蒸餾)的水，高純水中若含有極微量的無機(jī)離子雜質(zhì)，就好像流動相中含有的緩沖鹽一樣，通常對檢測結(jié)果不產(chǎn)生不良影響。高純水中若存在有機(jī)物雜質(zhì)，當(dāng)時(shí)對檢測好像也沒有什么影響，當(dāng)日積月累的雜質(zhì)吸附達(dá)到飽和時(shí)，在以后某次檢測中就有可能發(fā)生吸附雜質(zhì)的脫落，引起“鬼峰”現(xiàn)象，如果“鬼峰”疊加到了組分的吸收峰上面，就

3、會出現(xiàn)不準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)。1.3當(dāng)使用酸性的緩沖鹽流動相時(shí)，在pH為7左右時(shí)，首選磷酸鹽緩沖溶液作為流動相，因其緩沖范圍是pH=6.1～8.1；其次可選擇醋酸鹽緩沖溶液作為流動相，其緩沖范圍是pH=3.8～5.8。當(dāng)樣品的檢測波長在210nm附近時(shí)，不可使用含有醋酸或檸檬酸的緩沖液做流動相，因其本身在210nm波長處具有一定的吸收[1]。1.4當(dāng)檢測的樣品比較多時(shí)，所使用的流動相應(yīng)一次性足量配制完成，避免在檢測過程中由于添加流動相，而造成

4、被測組分峰面積的變化及保留時(shí)間的漂移。1.5流動相在使用前均應(yīng)進(jìn)行脫氣處理，避免溶解在其中的氣體影響基線的穩(wěn)定性和檢測的靈敏度。2.流路中流動相的存放流路中流動相的存放2.1如果當(dāng)天使用的是甲醇－水混合流動相系統(tǒng)，而且，次日仍然使用該流動相系統(tǒng)。檢測結(jié)束后用該流動相繼續(xù)沖洗色譜柱后，就可以關(guān)機(jī)。2.2如果在反相色譜法中使用了其他有機(jī)流動相或者是使用了加有緩沖鹽的流動相，檢測結(jié)束后應(yīng)該首先用適當(dāng)?shù)娜軇┣逑瓷V系統(tǒng)；溶劑的選擇、置換與混合請

5、參考下表。不可互相置換的溶劑組可能發(fā)生的問題應(yīng)采取的措施水與低極性溶劑（正己烷、氯仿等）乳濁、分層先用異丙醇或丙酮置換緩沖溶液與有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈、四氫呋喃）析出沉淀先用水置換稀硝酸和乙醇發(fā)生反應(yīng)先用水置換各個(gè)通道用所選擇的溶劑沖洗干凈后（每個(gè)通道沖洗20～30分鐘，柱壓高時(shí)需要增加沖洗時(shí)間），最后再用甲醇沖洗，洗凈后（柱壓很穩(wěn)定時(shí)）就可以關(guān)機(jī)。2.3儀器長時(shí)間不使用時(shí)，若使用過正相色譜法，色譜流路中用正己烷保持；若使用過反相色譜法，

6、一定要在各個(gè)流路中用甲醇保持，切忌在流路中長時(shí)間存在乙腈或高純水。有乙腈存在的流路中，乙腈會對比例閥中單向球閥的橡膠襯墊產(chǎn)生溶漲作用，致使其黏性增大并吸附流動相中微量的纖維絲等異物，久而久之會造成單向閥密封墊的不嚴(yán)密，引起比例閥不能夠按照設(shè)定的比例對各流路通道的流動相進(jìn)行混合，由此導(dǎo)致基線的波動。同理，也不能用高濃度（85%以上）的乙腈做流動相；例如，當(dāng)使用25%的乙腈和75%的緩沖鹽混合溶液作為流動相時(shí)，應(yīng)將兩者混勻后再使用，切忌在兩

7、個(gè)流路通道上利用比例閥來進(jìn)行混合調(diào)配，否則，也會發(fā)生上述現(xiàn)象。高純水在流路中長時(shí)間存在時(shí)，會引發(fā)細(xì)菌的生長。3可利用改變柱長、改變流動相的組成比例或提高柱溫（不得高于60℃）等方法解決此問題。5.色譜柱的再生色譜柱的再生[3]對于堵塞或吸附雜質(zhì)較為嚴(yán)重的色譜柱，可以進(jìn)行再生處理，方法是：5.1反相色譜柱（流動相極性大于固定相極性）：以甲醇－水（95∶5，體積比）、純甲醇及一氯甲烷等為流動相，依次沖洗，順序不得顛倒，每種流動相的沖洗體積應(yīng)

8、20倍于柱體積；然后，再以相反的順序依次沖洗。5.2正向色譜柱（流動相極性小于固定相極性）：以嚴(yán)格脫水的正己烷、異丙醇、一氯甲烷及甲醇為流動相，依次沖洗，順序不得顛倒，其他步驟同5.1。參考文獻(xiàn)[1]靳建中.如何正確使用高效液相色譜儀[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)200620:9～10.[2]劉迎貴方俊天韓漠等.獸藥分析檢測技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社2007.230235.[3]孫毓慶王延琮方群等.現(xiàn)代色譜法及其在藥物分析中的應(yīng)用[M]