microrna在白血病及腫瘤中的研究進(jìn)展

1、MicroRNA在腫瘤及白血病中的研究進(jìn)展,RNA的種類及主要功能,NON-CODING RNA: FORMERLY KNOWN AS “JUNK”,RNA Transcripts,Protein-coding mRNA,Non-coding RNA Transcripts,Regulatory RNAmiRNAsiRNAAnti-sense RNA,snoRNAs,Housekeeping RNAs,tRNArRNAsnRN

2、AtmRNAsRnase P RNAsvRNAsgRNAsMRP RNAsSRP RNAsTelomerase RNA,Transcription/chromatin structure regulatorsTranscriptional regulatorsProtein function modulatorsRNA/Protein localization regulators,MiRNA定義：,微小RNA(mi

3、croRNA, miRNA)是一種長(zhǎng)度約為22-28 nt的非編碼小分子RNA，miRNA通過(guò)與靶mRNA 3’UTR(Untranslated Regions,即非翻譯區(qū)，是mRNA分子兩端的非編碼片段)完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡。它們通過(guò)miRNA介導(dǎo)的特異性的基因沉默導(dǎo)致靶mRNA降解及抑制蛋白質(zhì)的合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平。miRNA對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和

4、凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。,MiRNA特征：,MicroRNA是一種長(zhǎng)度約為21nt的單鏈非編碼小分子RNA。在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。其通過(guò)與靶基因序列的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA 降解或阻遏其翻譯。MiRNA預(yù)計(jì)調(diào)控超過(guò)60%的蛋白編碼基因并且參與近乎所有已知的細(xì)胞進(jìn)程。,miRNAs的發(fā)現(xiàn),1993年，miRNA由哈佛大學(xué)Victor Ambros和Gary Ruvkun首次發(fā)現(xiàn) (lin-4)2000年，第二個(gè)miR

5、NA Let-7 在由哈佛大學(xué)博士后 Frank Slack 發(fā)現(xiàn)(Ruvkun lab),Victor Ambros,Gary Ruvkun,miRNA的研究思路,miRNA的研究方法,1. miRNA芯片技術(shù),將目前已經(jīng)克隆的miRNA或潛在miRNA制備成探針固定在尼龍膜或其它固相支持物上，然后與不同組別的總RNA或細(xì)胞器RNA雜交，通過(guò)信號(hào)的強(qiáng)弱比較探討miRNA 的表達(dá)狀況。 該方法類似于基因芯片技術(shù)，具有

6、高通量、快速等優(yōu)點(diǎn)，是目前疾病相關(guān)miRNA篩選常用的一種技術(shù)。,qRT-PCRNorthern Blot原位雜交技術(shù)等RNA-seq,miRNA芯片是目前篩選和研究miRNA調(diào)控的高通量手段,RNA-seq 是另一種高通量研究方法,RNA-Seq: a revolutionary tool for Transcriptomics，Nature,2009,10:57,有些miRNA具有類似抑癌基因功能，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控致瘤性靶

7、基因的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)功能；有些miRNA具有類似癌基因的作 用，通過(guò)下調(diào)抑瘤性靶基因的表達(dá)而發(fā)揮功能。,惡性腫瘤的microRNA結(jié)構(gòu)與表達(dá)異常,惡性腫瘤相關(guān)性microRNA,如果組織中某種或某些miRNA的表達(dá)失常，細(xì)胞內(nèi)許多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就會(huì)受到異常調(diào)控而表達(dá)失常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 。,有些miRNA具有類似抑癌基因功能，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控致瘤性靶 基因的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)功能；有些miRNA具有類似癌基因的作 用

8、，通過(guò)下調(diào)抑瘤性靶基因的表達(dá)而發(fā)揮功能。,惡性腫瘤的microRNA結(jié)構(gòu)與表達(dá)異常,惡性腫瘤相關(guān)性microRNA,如果組織中某種或某些miRNA的表達(dá)失常，細(xì)胞內(nèi)許多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就會(huì)受到異常調(diào)控而表達(dá)失常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 。,原癌基因與抑癌基因,原癌基因（proto-oncogene ）?癌基因(oncogene)Myc抑癌基因(cancer suppressor gene)p53,miR-21 （1）m

9、iR-21在乳腺癌、肝癌、腦瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著上 調(diào)，并與乳腺癌等腫瘤的惡性分級(jí)呈正相關(guān)；（2）miR-21 可能通過(guò)抑制其靶基因 TPM1(tropomyosin 1)的表達(dá)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。 （3）miR-21通過(guò)負(fù)調(diào)控抑癌基因PTEN的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力 。（4）通過(guò)抑制PCD4 (programmed cell death 4) mRNA的翻譯效率，抑制MCF-7的增殖。

10、,（一）致瘤性microRNA （onco-miRNA）,在microRNA (miRNA)家族中，有些miRNA具有類似癌基因功能，與腫瘤發(fā)生呈正相關(guān)，這部分miRNA稱為致瘤性miRNA（onco-miRNA），其過(guò)表達(dá)或持續(xù)活化將直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。,let-7 家族 (1) Let-7是2000年由Reinhart等在線蟲中發(fā)現(xiàn)的一種具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用的miRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)lin-47和lin-51的表達(dá)而控制

11、線蟲向成蟲的轉(zhuǎn)變。(2) Ras 是Let-7的直接靶基因，受到let-7家族的負(fù)性調(diào)控。Ras是 一個(gè)膜相關(guān)的GTPase信號(hào)蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化 的功能，是一個(gè)重要的瘤基因。(3) 在肺癌、乳腺癌、子宮癌等惡性腫瘤中，let-7家族與這些腫 瘤有關(guān)的脆性位點(diǎn)密切相關(guān)，在肺癌中其表達(dá)下調(diào)，是一個(gè) 與肺癌預(yù)后負(fù)相關(guān)的抑癌基因。,（二）抑瘤性microRNA (suppressor m

12、iRNA),在miRNA 家族中，有些miRNA具有類似抑癌基因功能，與腫瘤發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，稱為抑癌性miRNA（suppressor miRNA）。抑癌性miRNA的表達(dá)下降或者缺失，將直接導(dǎo)致腫瘤的形成。,17,miRNA與腫瘤發(fā)生的關(guān)系存在兩種可能的模式 [Caldas, et al.（Nature Medicine 2005）] ：1、若miRNA表達(dá)上調(diào)，其對(duì)應(yīng)抑癌基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，則可能導(dǎo)致腫 瘤發(fā)生；2、若mi

13、RNA表達(dá)下調(diào)，其對(duì)應(yīng)癌基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，同樣可能導(dǎo)致腫 瘤發(fā)生。,癌癥相關(guān) miRNAs 舉例,惡性腫瘤microRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常,（轉(zhuǎn)錄因子-microRNA-靶基因”交互作用的分子網(wǎng)絡(luò)）,1．轉(zhuǎn)錄因子對(duì)microRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的調(diào)控,2. microRNA對(duì)靶基因的調(diào)控,大部分miRNA具有自己一套獨(dú)立的順式作用元件（啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列），受到上游一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。類似于蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，這些轉(zhuǎn)錄因

14、子通過(guò)與miRNA的順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。,miRNAs與其靶基因3’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)并不是完全互補(bǔ)，可以存在短的錯(cuò)配和G-U配對(duì)，因此，miRNA調(diào)控多個(gè)靶基因。同時(shí)，同一個(gè)靶基因又同時(shí)受到多個(gè)miRNA的調(diào)控。 miR-21 →TPM1、PCD4和PTEN ；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195 → bcl-2,因此，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)miRNA分子，一個(gè)miRNA分子又同時(shí)

15、受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控；同時(shí)，一個(gè)miRNA分子能調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因又同時(shí)受到多個(gè)miRNA分子的協(xié)同調(diào)控；它們之間組成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人體生命活動(dòng)以及疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程的精細(xì)調(diào)控。,3．“轉(zhuǎn)錄因子-microRNA-靶基因”構(gòu)成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò),microRNA與腫瘤的診斷和治療,腫瘤的分子診斷與治療是分子醫(yī)學(xué)的重要組成部分，已成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。一些具有重要診斷和治療價(jià)值的分子標(biāo)志物已經(jīng)在臨床上

16、得到了廣泛的應(yīng)用，但由于特異性、敏感性或靶向性等方面的因素，其臨床應(yīng)用仍然受到很大局限 。由于miRNA在腫瘤多階段發(fā)生過(guò)程中具有獨(dú)特的表達(dá)特征和生物學(xué)功能，miRNA在腫瘤的分子診斷和治療中具有廣泛應(yīng)用前景。,一、microRNA與腫瘤的診斷,(一) 腫瘤組織特異性表達(dá)標(biāo)志物,miRNA 表達(dá)特征來(lái)對(duì)腫瘤進(jìn)行分類，并且篩選能對(duì)腫瘤進(jìn)行預(yù)后評(píng)估的miRNA標(biāo)記。,Lu等通過(guò)對(duì)多種組織來(lái)源腫瘤組織miRNA（約200個(gè)）表達(dá)譜進(jìn)行歸類

17、，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果與腫瘤組織的胚胎來(lái)源一致。例如，內(nèi)皮起源腫瘤，如直腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一類，血液系統(tǒng)來(lái)源的也被歸為一類。而16000個(gè)蛋白編碼基因的mRNA則不能將其聚在同一類。因此，腫瘤的miRNA表達(dá)特征反映了其發(fā)育起源，這也與miRNAs 指導(dǎo)組織特異性發(fā)育功能相一致。,1. 腫瘤的miRNA表達(dá)特征反映了其發(fā)育起源,許多的研究通過(guò)miRNA芯片技術(shù)系統(tǒng)研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血

18、病等腫瘤組織與其正常組織中的差異表達(dá)，構(gòu)建了相應(yīng)腫瘤組織與正常組織差異miRNA表達(dá)譜，篩選出了一些具有臨床診斷價(jià)值的分子靶標(biāo)。 如，miR-221、miR-301和miR-376a診斷胰腺癌。,(2) miRNA指導(dǎo)臨床腫瘤診斷,（3）miRNA非常穩(wěn)定,福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品中分離出來(lái)，這使得miRNA表達(dá)譜特征庫(kù)的建立成為可能。,(二) 腫瘤血清標(biāo)志物,血清的獲得相對(duì)比較簡(jiǎn)單、對(duì)病人創(chuàng)傷少，因此腫瘤血清標(biāo)志物越來(lái)越受到廣大

19、醫(yī)學(xué)研究者青睞。,（1）miRNA在血漿和血清中非常穩(wěn)定，它們被有效保護(hù)以避免接觸RNases，在嚴(yán)酷的環(huán)境條件下仍能保持穩(wěn)定。（2）miRNA在血漿和血清中穩(wěn)定性使得其實(shí)際值與在病人身上得到的測(cè)試值非常吻合。,第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血清miRNA標(biāo)志物是miR-21。Lawrie等人證實(shí)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤病人的血清miR-21水平很高，與淋巴瘤存活率呈負(fù)相關(guān)，是一個(gè)淋巴瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的理想分子靶標(biāo)。,二、microRNA與腫瘤治療,（1）

20、microRNA (miRNA)具有重要的生物學(xué)功能，參與腫瘤 的發(fā)生發(fā)展； （2）miRNA序列短，操控簡(jiǎn)單，基因藥物容易導(dǎo)入到宿主體 內(nèi)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為，達(dá)到治療腫瘤的 目的。 （3）根據(jù)miRNA的生物學(xué)功能，可以從癌基因和抑癌基因的 角度設(shè)計(jì)針對(duì)性藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。,針對(duì)致瘤性miRNA設(shè)計(jì)藥物： 人工合成的反義寡聚核苷

21、酸----抗miRNA寡聚核苷酸（AMOs）在滅活具有癌基因特性的miRNA表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為等方面取得了很大的突破。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與膽固醇偶聯(lián)的AMOs注射小鼠后，可以在小鼠的不同器官有效抑制靶miRNA活性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和惡性生物學(xué)行為。 針對(duì)抑瘤性miRNA設(shè)計(jì)藥物： 利用病毒或者脂質(zhì)體可以瞬時(shí)引入大量具有抑瘤基因的miRNA （如let-7 家族）。這些技術(shù)可以保證在某些組織特異性的啟