胡必杰肺部感染診斷難點病原學診斷的規(guī)范化和新技術

1、2024/3/15,Dr.HU Bijie,1,肺部感染診斷難點 ----病原學診斷的規(guī)范化和新技術,復旦大學附屬中山醫(yī)院Zhongshan Hospital of Fudan University胡必杰 Bijie HU,患者男性，44歲，咳嗽、咳痰12天，氣急5天痰少稍黃，發(fā)熱39.2C，查體兩肺濕性羅音；血WBC6500，P73％；胸片示兩肺炎癥,如何進行病原學檢查？痰培養(yǎng)×3次痰涂片革蘭染色鏡檢

2、痰找抗酸桿菌還有其他檢查項目嗎？,2024/3/15,Dr.HU Bijie,2,臨床情景,男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黃，發(fā)熱38.5C，查體于右下肺少許濕性羅音，胸片示右下肺炎。痰培養(yǎng)報告如下,痰培養(yǎng)報告（1）銅綠假單胞菌,痰培養(yǎng)報告（2）銅綠假單胞菌 少量生長,痰培養(yǎng)報告（3）無主要致病菌,痰培養(yǎng)報告（4）銅綠假單胞菌＋草綠色鏈球菌＋＋＋奈瑟菌 ＋＋＋,2024/3/15,Dr.HU

3、 Bijie,3,臨床情景,2024/3/15,Dr.HU Bijie,4,,The epidemiology of CAP among hospitalized adultsPorath A, Schlaeffer F, Lieberman D. J Infect 1997 Jan;34(1):41-8 ；Thorax 1996 Feb;51(2):179-84,%,病例：346。男占53% ，平均年齡 49.3 +/- 19.5

4、（17-94）；方法： 1年。血和胸水pleural fluid培養(yǎng)，特異血清試驗確定病原結果：80.6%找到病原，133（38.4％）為超過1種的病原體,62,148,35,101,56,20,19,21,2024/3/15,5,2024/3/15,Dr.HU Bijie,5,如何規(guī)范地選擇檢驗項目？,肺部感染病原學診斷有哪些項目,顯微鏡檢查 革蘭染色濕片檢查分枝桿菌檢查肺孢子菌檢查（BAL）肺組織標本培養(yǎng)：細菌與真菌

5、普通菌，厭氧菌，結核菌，真菌定量/半定量培養(yǎng),免疫學方法抗原：尿可溶性抗原，GM，隱球菌抗體：肺吸蟲。。。組織病理學結核與其他分枝桿菌真菌（曲霉，隱球菌）分子生物學核酸檢測其他,2024/3/15,Dr.HU Bijie,6,胸腔積液能做哪些檢查？,涂片檢查對培養(yǎng)陰性者的價值尤為重要普通培養(yǎng)將胸水直接注入血培養(yǎng)瓶內送檢，可提高檢出率。但可有皮膚非致病菌污染經胸腔留置導管采集的胸水標本，分離的細菌可能只是定植，

6、應注意鑒別厭氧培養(yǎng)結核菌培養(yǎng)陽性率？抗原檢測如流桿b型、肺鏈、軍團菌或隱球菌,2024/3/15,Dr.HU Bijie,7,2024/3/15,Dr.HU Bijie,8,住院病人社區(qū)獲得性肺炎單病種質量控制,判斷是否符合入院標準氧合評估病原學診斷住院24小時以內，采集血、痰培養(yǎng)在首次抗菌藥物治療前，采集血、痰培養(yǎng) 抗菌藥物時機入院8h/4h/6h內接受抗菌藥物治療起始抗菌藥物選擇重癥與非重癥患者起

7、始抗菌藥物選擇目標抗感染藥物的治療選擇初始治療72小時后無效者，重復病原學檢查抗菌藥物療程（平均天數(shù)）為患者提供：戒煙咨詢/健康輔導符合出院標準及時出院平均住院日/住院費用,2024/3/15,Dr.HU Bijie,9,上海市《感染病原學診斷和耐藥性監(jiān)測》評價指標,2024/3/15,Dr.HU Bijie,10,,,,,香港瑪麗醫(yī)院微生物檢驗申請單,改革微生物檢驗申請單,2024/3/15,Dr.HU Bijie,11

8、,患者女性，44歲，咳嗽、咳痰12天，氣急5天痰少稍黃，發(fā)熱39.2C，外院胸片示兩肺廣泛炎癥，以上肺為多，先后用青霉素、頭孢曲松、頭孢他啶等治療無效。查體兩肺濕性羅音。血WBC6500，P73％。,會診要求如何選擇抗感染藥物？,病原學檢查情況痰涂片革蘭染色鏡檢痰找抗酸桿菌軍團菌抗體檢測和軍團菌培養(yǎng),臨床情景,右上肺空洞,肺膿腫？痰培養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)結核空洞？痰找抗酸桿菌結核菌培養(yǎng)肺真菌感染？,2024/3/15,Dr.

9、HU Bijie,12,兩肺彌漫性結節(jié)伴空洞,男，65歲咳嗽數(shù)周無咯血、發(fā)熱胸部CT示兩肺多發(fā)結節(jié)伴空洞進一步檢查？,2024/3/15,Dr.HU Bijie,13,2024/3/15,Dr.HU Bijie,14,某男，46歲，心臟移植術后2月余。高熱5天伴咳嗽入院。CT示兩肺炎癥，之后應用萬古霉素、泰能、氟康唑等多種抗菌藥物治療無效，仍高熱，并出現(xiàn)進行性加重的呼吸困難。痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)等均陰性,會診要求還要做哪些病原學檢

10、查項目？如何選擇抗感染藥物？,臨床情景,2024/3/15,Dr.HU Bijie,15,143,新型隱球菌溶膠凝集試驗,2024/3/15,16,2024/3/15,Dr.HU Bijie,16,如何規(guī)范地采集和運送標本？,2024/3/15,Dr.HU Bijie,17,關于咳痰標本,在抗生素應用前采集痰標本;標本采集后1～2h內必須立即進行實驗室處理；咳痰標本應用最早且廣泛，但也是最受爭議的標本 ;取標本前應摘去牙托，清潔

11、口腔如刷牙和漱口;深咳，采集標本過程中要有專業(yè)的醫(yī)務人員指導;無痰可用3％～5％NaCl 5ml霧吸約5min導痰；也可用物理療法、體位引流、鼻導管抽吸等法取痰；對于細菌性肺炎，痰標本送檢每天1次，連續(xù)2～3天。不建議24h內多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變；懷疑分枝桿菌感染者，應連續(xù)收集3天清晨痰液送檢,2024/3/15,Dr.HU Bijie,18,幾種下呼吸道直接采集的標本,經氣管穿刺吸引transtracheal

12、aspiration,TTA 經胸壁針刺吸引transthoracic needle aspiration, TNA 經支氣管鏡采樣 支氣管肺泡灌洗bronchoalveolar lavage, BAL經支氣管鏡直接吸引防污染樣本毛刷protective specimen brush, PSB開胸肺活檢open-lung biopsy，OLB經人工氣道吸引分泌物 endotracheal aspirates，ETA,202

13、4/3/15,Dr.HU Bijie,19,經支氣管鏡采樣,簡單吸引、刷檢、活檢、灌洗(PSB,TBLB,PBAL)方法多樣、適應不同標本采集要求,2024/3/15,Dr.HU Bijie,20,經人工氣道采樣,導管吸痰（ETA）防污染毛刷(PSB)防污染灌洗(PBAL),2024/3/15,Dr.HU Bijie,21,經胸壁肺吸引、活檢,X線透視下、B超、CT引導下有一定的并發(fā)癥氣胸、出血、空氣栓塞常用于貼近胸壁的病灶

14、,2024/3/15,22,2024/3/15,Dr.HU Bijie,22,如何規(guī)范地進行微生物檢驗？,呼吸道標本的規(guī)范檢驗,培養(yǎng)前處理痰標本質量評價痰標本的勻化定量或半定量培養(yǎng)培養(yǎng)條件培養(yǎng)平皿二氧化碳孵箱,2024/3/15,Dr.HU Bijie,23,2024/3/15,Dr.HU Bijie,24,細胞學篩選標本,合格標本應是從下呼吸道咳出的痰，內含頰部鱗狀上皮細胞少，而白細胞較多不合格標本指唾液或唾液嚴

15、重污染的痰標本，含鱗狀上皮細胞多，而白細胞少,2024/3/15,Dr.HU Bijie,25,咳痰標本質量評估：細胞學篩選,*SEC25，分別賦分0、-1和-2；WBC25，賦分0、1和2；粘稠或膿性痰液賦分值１,2024/3/15,Dr.HU Bijie,26,5種篩選標準判斷14001份痰標本合格率比較,2024/3/15,Dr.HU Bijie,27,咳痰標本不合格，你退檢嗎？,如果低倍視野下鱗狀上皮細胞大于10個，應不

16、做或僅在特殊要求時做培養(yǎng)。如做培養(yǎng)，報告中注明“鏡檢結果表明標本口咽分泌物污染明顯”。復旦大學中山醫(yī)院的做法痰液外觀：膿性，粘膿，粘液，水樣…..鏡檢：WBC？，SEC？痰標本質量評價：合格，不理想（建議重送）,2024/3/15,Dr.HU Bijie,28,痰標本的洗滌與消化,洗滌滅菌等滲氯化鈉液系列平皿內順次漂洗，或置于孔徑1mm的濾器上等滲氯化鈉沖洗。洗滌可除去痰液外層水樣唾液，保留來自下呼吸道的粘稠或膿性成分。

17、消化乙酰半胱氨酸等消化液，以蛋白水解酶和粘液溶解劑應用最多。消化過程有助于痰核內部細菌的暴露，提高痰標本培養(yǎng)的陽性撿出率超聲液化（？）,2024/3/15,Dr.HU Bijie,29,下呼吸道標本涂片染色鏡檢,初步病原學診斷：高質量痰標本涂片染色或濕片檢查傾向性診斷：抗酸桿菌、放線菌、奴卡菌、一些真菌以及肺胞子菌、寄生蟲。熒光顯微鏡：可用于軍團菌、結核分枝桿菌等,2024/3/15,Dr.HU Bijie,30,革蘭染色油鏡

18、檢查,可較清楚觀察細菌的形態(tài)，大致判斷細菌種屬。一定特征性的病原體如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌，經驗豐富時可作出較為可靠的判定。在觀察視野及周圍不存在鱗狀上皮細胞但見到一些炎性細胞或柱狀上皮細胞的視野內，如發(fā)現(xiàn)較多形態(tài)單一的GNB，對肺部感染病原體的診斷有參考價值革蘭染色鏡檢結果必須要立即向臨床報告，尤其是ICU病人的經人工氣道的吸引（ETA）標本痰標本巧克力瓊脂培養(yǎng)基的接種，僅限于每油鏡視野≥10個類似嗜血桿菌或類似

19、奈瑟菌。胸腔積液和膿胸做革蘭染色涂片可明確細菌的類型和采取相對應的抗菌治療方案。經支氣管鏡的沖洗液（除BAL）和支氣管的抽吸物，口咽污染均不能避免,2024/3/15,Dr.HU Bijie,31,CAP: 痰液革蘭染色作用不清楚,目的: CAP病人痰革蘭染色檢測肺炎鏈球菌作用方法: 檢索Medline 1966 to 1993英文發(fā)表論文 (檢索詞: sputum,Gram's stain,pneumonia) 規(guī)

20、則: 3 名盲法評述者獨立判讀文獻入選: 11 篇前瞻性研究和 1篇回顧性研究共1322 pt證據(jù): 敏感性15%~100% , 特異性11%~100%. 多數(shù)研究敏感性< 70%評述: 70%系膿性痰. 缺陷:限Medline英文文獻;樣本數(shù)、研究規(guī)模、盲法、陽性結果的定義或抗生素使用對照與試驗特征無統(tǒng)計學上的相關性,Reed WW, et al: Sputum Gram's stain in community-

21、acquired pneumococcal pneumonia: a meta-analysis. Western Journal of Medicine 1996; 165: 197-204,2024/3/15,Dr.HU Bijie,32,濕片檢查,真菌檢查：與含有10%甘油的10%KOH混合于載玻片上，蓋上蓋玻片，濕盒中放置15～30min有經驗的技術員可輕易識別皮炎芽生菌、粗球孢子菌和新型隱球菌；可檢出絲狀菌；有動力的病原

22、體，如一種引起二重感染的糞小桿線蟲，可以在濕片中發(fā)現(xiàn)。鞭毛蟲（？）,,,,2024/3/15,Dr.HU Bijie,33,2024/3/15,Dr.HU Bijie,34,BAL離心沉淀物細胞學檢查推薦,2024/3/15,Dr.HU Bijie,35,咳痰培養(yǎng)必須用半定量方法,定性鑒定的普通培養(yǎng)方法不易區(qū)分感染菌或污染菌；標準定量培養(yǎng)方法繁瑣，建議用半定量方法；方法：四區(qū)劃線接種標本進行培養(yǎng)，每劃一區(qū)后均需火燒接種環(huán)，使細菌在

23、平板上生長數(shù)逐級下降；報告：優(yōu)勢菌生長菌落為3+或3+以上。也可分大量heavy、中等量moderate和少量scattering生長三種；可以只鑒定和報告優(yōu)勢生長的需氧菌和兼性厭氧菌。只在原始區(qū)生長的少數(shù)菌不必作常規(guī)鑒定，除非臨床或直接革蘭染色提示可能為感染的病原菌。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,36,劃線接種平板半定量判斷標準,2024/3/15,Dr.HU Bijie,37,痰標本的培養(yǎng)基選擇,培養(yǎng)基包括分離和

24、鑒別革蘭陽性菌的血平板、革蘭陰性菌鑒別的平板如麥康凱平板；涂片顯示嗜血桿菌樣或奈瑟菌樣的優(yōu)勢菌（每油鏡視野≥10個細菌）時，應增加接種富含營養(yǎng)的巧克力平板，分離流桿、腦膜炎、卡他；痰涂片發(fā)現(xiàn)較多GNB或系醫(yī)院內肺炎的痰標本，應加麥康凱平板；應少用培養(yǎng)平板進行細菌分離，要熟悉細菌在培養(yǎng)基上的生長模式，而不是靠選擇培養(yǎng)基。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,38,培養(yǎng)環(huán)境：CO2,平板置于3％～10％CO2中35-37℃孵育

25、。燭缸可基本達到這一要求，但近年來的研究顯示用CO2培養(yǎng)箱分離肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌要明顯優(yōu)于燭缸。為提高細菌培養(yǎng)和分離質量，細菌室應常規(guī)配備CO2培養(yǎng)箱，呼吸道標本在初代培養(yǎng)時尤為重要。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,39,菌落觀察與鑒定,平板孵育過夜（18-24h），觀察并記錄有幾種不同的菌落類型?？忍禈吮荆簝?yōu)勢菌幾種菌落應分離鑒定。直接采集的下呼吸道標本如PSB、BAL、TNA、胸腔穿刺液中生長的所有菌落類

26、型均應鑒定。如果病人已接受抗生素治療或革蘭染色所見細菌未分離到，48h后應重新觀察平板。某一菌落是否需要鑒定，應根據(jù)其引起下呼吸道感染的可能性和病例的臨床特征來決定。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,40,鏈球菌,α溶血的鏈球菌：必須采樣客觀的方法如Optochin試驗、膽汁溶解試驗和莢膜腫脹試驗，來鑒別草綠色鏈球菌和肺炎鏈球菌。草綠色鏈球菌：不要進一步鑒定至種水平。β溶血性鏈球菌：至少應根據(jù)免疫方法或桿菌肽敏感性測

27、定，鑒定為A群和非A群鏈球菌。非溶血性鏈球菌：如此報告即可，不必鑒定至種水平。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,41,葡萄球菌,金葡菌：致病力較強，必須與其他葡萄球菌相鑒別。其他葡萄球菌：很少引起下呼吸道感染，通常報告為凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）便可。如果是血液或通常為無菌部位標本如胸水分離出的細菌，或醫(yī)院感染標本需要追蹤傳染源時，應進一步做有關生化試驗將凝固酶陰性葡萄球菌鑒定至種的水平。,2024/3/15,Dr.

28、HU Bijie,42,卡他莫拉菌和腦膜炎奈瑟菌,卡他莫拉菌：肺炎的常見病原菌，要分離、鑒定痰培養(yǎng)中的疑似卡他莫拉菌。奈瑟菌屬：咳痰標本中分離的奈瑟菌通常不需要鑒定到種。只有在臨床醫(yī)生建議、或涂片革蘭染色有典型的特征即見大量胞內革蘭陰性雙球菌、或培養(yǎng)見大量單一形態(tài)的奈瑟菌純培養(yǎng)，提示腦膜炎奈瑟菌是引起肺炎的病原體時，可作進一步鑒定。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,43,嗜血桿菌,流感嗜血桿菌：需5～10％CO2，X和V因

29、子副流感嗜血桿菌：臨床分離很多，大多數(shù)系非致病的上呼吸道正常菌群,2024/3/15,Dr.HU Bijie,44,腸桿菌科,在分離平板中容易被發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定。采用同一標準處理腸桿菌科細菌和其他可能的感染病原菌。優(yōu)勢菌時，應分離鑒定到種的水平。多種GNB時，鑒定前，最好要與臨床醫(yī)生討論其可能的臨床意義（？）,2024/3/15,Dr.HU Bijie,45,革蘭陽性桿菌,呼吸道最常見的需氧或兼性厭氧革蘭陽性桿菌是棒狀桿菌。白喉

30、棒狀桿菌：主要引起上呼吸道感染，很少累及下呼吸道。咽拭子培養(yǎng)要留意此菌鑒別。類白喉桿菌：很少引起下呼吸道感染，不必進行鑒定，除非分泌物涂片染色檢查系優(yōu)勢菌。類白喉桿菌可根據(jù)菌落和鏡下形態(tài)進行報告，大部分菌觸酶陽性。,2024/3/15,Dr.HU Bijie,46,痰液細菌學檢查程序,2024/3/15,Dr.HU Bijie,47,快速報告與需要延長培養(yǎng)時間問題,使用抗菌藥物后卡他莫拉菌 48h曲霉菌與其他絲狀真菌,2024/3

31、/15,48,2024/3/15,Dr.HU Bijie,48,如何正確閱讀微生物檢驗報告？,2024/3/15,Dr.HU Bijie,49,肺部細菌性感染病原診斷：確定意義,① 血或胸液培養(yǎng)到病原菌② 纖支鏡或人工氣道吸引標本細菌>105cfu/ml（2+）BALF：細菌≥104cfu/ml（1-2+）PSB、PBALF：細菌>103cfu/ml（1+）,2024/3/15,Dr.HU Bijie,

32、50,肺部細菌性感染病原診斷：有意義,① 合格痰標本培養(yǎng)致病或條件致病菌≥3+② 少量生長，但與鏡檢結果一致 （肺球、流感、卡他莫拉菌）③ 入院3天內多次培養(yǎng)到相同細菌,2024/3/15,Dr.HU Bijie,51,肺部細菌性感染病原診斷：無意義,①痰培養(yǎng)到上呼吸道正常菌草鏈、表葡、非致病奈瑟菌、類白喉桿菌等②多種病原菌少量生長③不符上述“ 確定”和“ 有意義”條款,2024/3/15,Dr.HU Bijie,52,

33、【病例】患者男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黃，發(fā)熱38.5C，查體于右下肺少許濕性羅音，胸片示右下肺炎,咳痰培養(yǎng)結果：綠膿桿菌＋草綠色鏈球菌＋＋＋奈瑟菌＋＋＋肺部感染最可能的病原體？,2024/3/15,Dr.HU Bijie,53,【病例】患者男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黃，發(fā)熱38.5C，查體于右下肺少許濕性羅音，胸片示右下肺炎,咳痰培養(yǎng)結果：綠膿桿菌＋＋＋草綠色鏈球菌＋

34、奈瑟菌＋肺部感染最可能的病原體？,2024/3/15,Dr.HU Bijie,54,感染菌與污染菌的區(qū)分,2024/3/15,Dr.HU Bijie,55,陰性培養(yǎng)結果分析,抗生素影響苛養(yǎng)菌特殊病原體檢驗技術受限采樣運送不當非感染性疾病,2024/3/15,Dr.HU Bijie,56,普通培養(yǎng)基不生長的其他病原,主要病原體厭氧菌：類桿菌、梭桿菌、厭氧球菌真 菌：曲霉（生長慢）、隱球菌、組織胞漿菌、PC寄

35、生蟲：肺吸蟲等評述：需要相應的培養(yǎng)或組織病理學檢查,2024/3/15,57,2024/3/15,Dr.HU Bijie,57,病原學診斷的特殊技術與新技術,2024/3/15,Dr.HU Bijie,58,2024/3/15,Dr.HU Bijie,59,病毒培養(yǎng)是常規(guī),2024/3/15,Dr.HU Bijie,60,2024/3/15,Dr.HU Bijie,61,2024/3/15,Dr.HU Bijie,62,定期更新和評

36、估檢驗方法值得關注的一部分項目,推行呼吸道細菌學標本的細胞學篩選和半定量培養(yǎng)方法呼吸道非典型病原體的血清學方法痰涂片熒光法檢測分支桿菌非結核分枝桿菌的培養(yǎng)與藥敏ICH特殊病原體的檢測，如巨細胞病毒，卡氏肺孢子蟲尿抗原檢測快速診斷軍團菌感染抗生素相關腹瀉的病原體（主要是艱難梭菌）的檢測建立念珠菌快速培養(yǎng)和藥敏試驗,2024/3/15,Dr.HU Bijie,63,CAP需要進行病原學檢查的臨床情形（HAP呢？）,挑戰(zhàn)：

37、我國臨床微生物實驗室對呼吸道病毒檢驗技術嚴重滯后,案例重癥社區(qū)肺炎的病毒類微生物很難送檢原因大多數(shù)快速檢驗的試劑盒國內沒有引進通常送CDC實驗室程序復雜早期快速診斷有難度,2024/3/15,Dr.HU Bijie,64,2024/3/15,Dr.HU Bijie,65,我國亟需引進、建立非培養(yǎng)的病原體檢測技術,GM試驗，G試驗軍團菌和肺炎鏈球菌尿可溶性抗原檢測肺炎支原體、肺炎衣原體血清學檢測呼吸道病毒檢測,2024/