ung酶在pcr中的作用

1、UNG酶在酶在PCR中的作用中的作用UNG酶UracilNglycosylase尿嘧啶N糖基化酶(UNG)酶原理：UNG酶的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失鹼基的DNA鏈在鹼性介質(zhì)，高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，從而被消除.UNG酶的最佳活性溫度為50℃，95℃滅活。作用：為保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施是使用UNG酶(UracilNGlycosylase)和

2、Taq酶熱啟動(dòng)。PCR反應(yīng)最常見，最重要的污染物是PCR產(chǎn)物，防污染熱啟動(dòng)PCR試劑盒以dUTP取代dTTP，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟，UNG酶即可將反應(yīng)體系中已有的UDNA污染物中的尿嘧啶鹼基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性。同時(shí)UNG酶被滅活，不會(huì)再降解新擴(kuò)增的產(chǎn)物UDNA。高品質(zhì)的UNG酶可以消除高達(dá)108的U

3、DNA產(chǎn)物，和熱啟動(dòng)Taq酶一同用于建立含有UNGdUTP防污染體系的熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)系統(tǒng)。UNG酶特征酶特征?克隆有EcoliK12UracilNGlycosylase基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，再經(jīng)三次過柱純化分離出來的重組蛋白。分子量25.66KDa。?反應(yīng)條件：50℃，2分鐘；反應(yīng)buffer:20mMTrisHCl(PH:8.0)1mMEDTA1mMDTT。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段

4、效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。1.原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。2.dUTP法

5、：用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。3.dU引物法：合成引物時(shí)以dU代dT，這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長片段（12kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。dU引物最好將dU設(shè)計(jì)在3

6、ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。4.優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。5.需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉。這個(gè)原因太多了假陽性就是現(xiàn)在的上海生工的產(chǎn)品也有時(shí)會(huì)產(chǎn)生這樣的情況，原因很多甚至包括反應(yīng)時(shí)mg2濃

7、度，反應(yīng)時(shí)間，退火溫度.....但從污染角度講主要有以下幾種可能PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱.(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用.(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照.(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR

8、產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止.(七)選擇質(zhì)量好的Eppendf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出.4、PCR污染解決對(duì)策（這是從另一篇文章總結(jié)而來，與前面的部分略有重復(fù)，大家隨便看看吧）PCR檢測微量感染因子時(shí)，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題。一污染的預(yù)防進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)

9、。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：1.標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；2.PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增；3.產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)

10、的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA：1PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；2引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；3引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。(三)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的

11、交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：1.戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；2.使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3.避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4.操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP