肝細(xì)胞死亡的基礎(chǔ)與臨床研究

1、肝細(xì)胞死亡的基礎(chǔ)與臨床研究,同濟(jì)醫(yī)院感染性疾病研究所同濟(jì)醫(yī)院感染科寧琴 教授,,,,,內(nèi)容,肝細(xì)胞死亡的模式,肝細(xì)胞死亡與肝臟疾病,肝細(xì)胞死亡的調(diào)控,結(jié)論,1,2,3,4,凋亡啟動(dòng)原因 死亡受體/配體 DNA損傷 生長(zhǎng)因子缺乏主動(dòng)過(guò)程程序性細(xì)胞死亡,壞死繼發(fā)于 重型病毒性肝炎 缺血/再灌注損傷 急性藥物性肝炎被動(dòng)過(guò)程

2、 顯著的炎癥反應(yīng),肝細(xì)胞死亡的模式,,,,,肝細(xì)胞死亡,細(xì)胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別,舊觀點(diǎn)凋亡與壞死被認(rèn)為是兩種截然不同的現(xiàn)象 新觀點(diǎn)凋亡與壞死是源于相同啟動(dòng)因素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同的細(xì)胞死亡方式，而線粒體功能損傷在這一過(guò)程中起到關(guān)鍵的連接作用。,,,,線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心,,氧化磷酸化中心,細(xì)胞凋亡調(diào)控中心,細(xì)胞呼吸鏈中心,線粒體,,,,凋亡存在兩條不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,一類細(xì)胞中含有足

3、夠的Caspase8可被經(jīng)典的死亡受體活化，直接激活效應(yīng)Caspase；另一類細(xì)胞其死亡受體介導(dǎo)的Caspase8活化不能達(dá)到很高的水平，凋亡信號(hào)需要借助線粒體途徑來(lái)放大，而細(xì)胞色素C的釋放是這一途徑的關(guān)鍵步驟。,線粒體在凋亡中的作用,缺血再灌注，肝細(xì)胞毒素（N-乙酰苯醌亞胺 NAPQI ，膽酸，死亡受體活化等） 集中作用于線粒體，導(dǎo)致其膜透化。 Bcl2家族成員包括caspase 8 活化形成的tBid,導(dǎo)致外膜透化。其透化可

4、能包括外膜通道的形成或是線粒體腫脹破裂后誘導(dǎo)MPT。 其他應(yīng)激因素可直接導(dǎo)致MPT.膜透化后，細(xì)胞色素C釋放相繼激活caspase 9 和caspase 3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 。而由于線粒體功能的嚴(yán)重異常，ATP減少，caspase 活化被阻斷則會(huì)發(fā)生壞死。,壞死和凋亡是線粒體透化的不同結(jié)果,肝細(xì)胞死亡與肝臟疾病,1.死亡受體/配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,目前認(rèn)為在肝臟中發(fā)揮重要作用的死亡受體主要包括Fas、TNFR1及TRAIL-R1

5、/R2，后者與它們相應(yīng)的配體FasL、TNFα和TRAIL結(jié)合后可誘導(dǎo)受體發(fā)生寡聚化并活化其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)的連接蛋白相互作用進(jìn)而觸發(fā)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。,1.死亡受體/配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,1）Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,Fas在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞及枯否氏細(xì)胞上具有廣泛的表達(dá)。 自然殺傷細(xì)（NK）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）可通過(guò)分泌FasL啟動(dòng)凋亡程序來(lái)清除病毒感染 的肝細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。,

6、NK細(xì)胞殺傷自身肝細(xì)胞的機(jī)制,Hepatology. 2004J Exp Med. 2007Hepatology. 2007,CTL細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的殺傷作用,1）Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,研究發(fā)現(xiàn) 乙型、丙型病毒性肝炎患者體內(nèi)可溶性Fas的表達(dá)有所增加，且表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度及治療應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。 當(dāng)HCV特異性的FasL表達(dá)的CTL被動(dòng)移植至穩(wěn)定表達(dá)HCV結(jié)構(gòu)蛋白的小鼠體內(nèi)后，小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）

7、水平升高。在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，HBV特異性CTL也能導(dǎo)致急性肝損傷甚至肝衰竭 酒精性肝炎患者的血清中可以發(fā)現(xiàn)其可溶性Fas的表達(dá)也是上調(diào)的 酒精和HCV病毒可在Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)的肝臟損傷中發(fā)揮協(xié)同作用 非酒精性脂肪肝患者中，其Fas的表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生也是增加的。 Fas誘導(dǎo)的凋亡在暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地,2）TRAILR/TRAIL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,研究發(fā)現(xiàn)病毒性肝炎患者中其血清TRAIL的表

8、達(dá)水平顯著增高；小鼠肝細(xì)胞在病毒感染后也能誘導(dǎo)上調(diào)TRAIL的表達(dá)，通過(guò)TRAILR/TRAIL途徑誘導(dǎo)感染肝細(xì)胞的凋亡。,Fas 和 TRAIL 受體信號(hào),Fas 和TRAIL 的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物 (DISC) 類似. TRAILR1/TRAIL-R2或Fas 與其配體 TRAIL或FasL結(jié)合后，通過(guò)與死亡結(jié)構(gòu)域(DD)的同型反應(yīng)招募調(diào)節(jié)蛋白FADD。FADD 包含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)，可招募并分裂procasp

9、ase 8 和10, 使其活化。Caspase 8 將Bid分裂為tBid，致使線粒體透化，功能失常和凋亡。,,,3）TNFR1/TNFα誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,正常肝細(xì)胞中TNFR1的表達(dá)水平很低，但各種急慢性肝臟疾病中，TNFR1會(huì)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞和炎性浸潤(rùn)細(xì)胞中大量表達(dá)。除了誘導(dǎo)凋亡途徑，TNFα還能通過(guò)NFκB依賴的基因表達(dá)途徑促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，在部分肝切除后肝細(xì)胞的再生中起重要作用。 TNFR表達(dá)過(guò)量時(shí)會(huì)導(dǎo)致

10、肝細(xì)胞損傷加劇而肝臟再生失敗。,3）TNFR1/TNFα誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,在肝臟移植中，供體與受體的TNFR1發(fā)揮相反的效應(yīng)，表現(xiàn)為供體TNFR1的缺陷可加劇移植物的損傷，而受體TNFR1缺陷時(shí)肝損傷有所緩和且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。在酒精性肝炎患者中，其血清TNFα和TNFR1的水平均上升并與死亡率相關(guān)。病毒性肝炎患者中，其TNFα的水平與治療應(yīng)答反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。,TNFa受體介導(dǎo)的信號(hào),TNF與TNFR結(jié)合后，與TRADD, RIP,

11、TRAF-2共同形成Complex I，激活 NFkB 和JNK. NFkB 激活某些survival gene(包括抗凋亡蛋白c-FLIP, IAPs, Bcl-XL和 A1)的轉(zhuǎn)錄。 Complex I 經(jīng)過(guò)修飾和內(nèi)化形成Complex II (DISC) ,后通過(guò)與DD的相互作用及激活procaspase 8來(lái)招募FADD（Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域）。活化的 caspase 8 將Bid （促凋亡蛋白）分裂為 tBid, 轉(zhuǎn)移至線粒體

12、后導(dǎo)致其透化，功能障礙及凋亡。,2.穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,穿孔素(perforin)主要存在于CTL和NK細(xì)胞的胞漿中,是CTL和NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)的另一重要途徑。,2.穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,穿孔素可在靶細(xì)胞膜上形成跨膜孔道 1）引起細(xì)胞滲透性改 變、鈣離子內(nèi)流和能 量的耗竭，導(dǎo)致靶細(xì) 胞融解和細(xì)胞死亡。 2）穿孔素形成的跨膜通 道可以使顆粒酶

13、 （granzyme）進(jìn)入靶 細(xì)胞，顆粒酶進(jìn)一步 通過(guò)蛋白水解激活 Caspase家族的某些 成員觸發(fā)Caspase級(jí) 聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞 凋亡。,2.穿孔素/顆粒酶誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,研究發(fā)現(xiàn)，穿孔素在慢性乙肝肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝細(xì)胞損傷的主要效應(yīng)分子。,3.缺血/缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,1.缺血-再灌注損傷

14、 2.免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死,1）缺血-再灌注損傷,發(fā)生于肝臟的缺血-再灌注損傷可分為兩個(gè)階段:第一階段 反映了直接的肝細(xì)胞損傷。第二階段 涉及到天然免疫系統(tǒng)的激活，特別是缺血后肝 臟枯否氏細(xì)胞的活化，以及中性粒細(xì)胞、淋巴 細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)。,缺血-再灌注損傷,在肝細(xì)胞的體外熱缺血-再灌注損傷模型中 ，肝細(xì)胞急劇腫脹壞死。 體內(nèi)肝臟發(fā)生缺血-再灌注損傷

15、后，其急性階段也主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞的壞死。,缺血-再灌注損傷,其他觀點(diǎn) 缺血-再灌注損傷后，肝細(xì)胞的凋亡和壞死是并存的，損傷的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間決定了細(xì)胞的死亡方式，即嚴(yán)重的損傷會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)生的肝細(xì)胞壞死，而輕度的損傷則發(fā)生延遲的凋亡反應(yīng)。,免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死,免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死,系列研究發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞）/fgl2凝血酶原酶介導(dǎo)的免疫凝血途徑可通過(guò)促進(jìn)肝臟纖維素沉積和微血栓形成引發(fā)肝臟的微循環(huán)障礙，最終

16、肝細(xì)胞 缺血缺氧，ATP合成障礙而觸發(fā)肝細(xì)胞壞死的發(fā)生。,J Virol, 1997, J Immunol 1998, J Clin Invest 2003, 中華醫(yī)學(xué)雜志２００３ W J G 2006, Human Gene Therapy 2006，中化肝臟病雜志?。玻埃埃矗玻埃埃稪 Biol Chem. 1999, and J Biol Chem 2003,肝內(nèi)枯否氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞fgl2高表達(dá)，是暴發(fā)性肝炎肝細(xì)胞壞死的重

17、要機(jī)制,膽酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，毒性膽鹽可以通過(guò)Fas或TRAIL依賴的途徑引起肝細(xì)胞凋亡。 在急性膽汁淤積的發(fā)生中，F(xiàn)as及其他信號(hào)途徑也能導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體功能障礙及ATP的耗竭，促進(jìn)細(xì)胞壞死的發(fā)生。,藥物誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,在美國(guó)對(duì)乙酰氨基酚的過(guò)量使用是造成急性藥物性肝損傷的主要原因 肝細(xì)胞凋亡與壞死共存于對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷： 1）當(dāng)藥物造成了ATP的完全耗竭，肝細(xì)胞壞死發(fā)生；

18、 2）當(dāng)D-果糖與甘氨酸的運(yùn)用減緩了ATP的耗竭，則Caspase誘導(dǎo)的凋亡途徑占優(yōu)勢(shì)。,肝細(xì)胞死亡的調(diào)控,1. 正常肝細(xì)胞死亡的干預(yù)2. 異常肝細(xì)胞死亡的誘導(dǎo),正常肝細(xì)胞死亡的干預(yù),Caspase抑制劑抗氧化劑凋亡壞死關(guān)鍵基因的RNA干擾細(xì)胞因子中草藥 血漿置換,異常肝細(xì)胞死亡的誘導(dǎo),選擇性的增加腫瘤細(xì)胞對(duì)于TRAIL介導(dǎo)的凋亡途徑的敏感性，有助于清除肝臟腫瘤細(xì)胞，保護(hù)正常的肝細(xì)胞。 通過(guò)藥物和基因干預(yù)手段靶向誘導(dǎo)