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文檔簡介
1、一、骨髓間充質(zhì)干細胞治療急性血管損傷研究
骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)是來源于中胚層的一類多能干細胞,主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。其具有強大的增殖能力和多向分化潛能,在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞(ECs)和血管平滑肌細胞(VSMCs)等。MSCs移植后可遷移到多種組織,其具備的向ECs分化的特性為其促損傷血管內(nèi)膜修復(fù)提供了一定的理論
2、依據(jù),但因其也具有向VSMCs分化的特性,使MSCs移植治療損傷血管的結(jié)局具有一定的不確定性。本研究通過靜脈移植的方法,探討MSCs在急性血管損傷修復(fù)中的作用及體內(nèi)的歸巢分化,并比較未經(jīng)誘導(dǎo)MSCs及誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮樣細胞(endothelial-like cells,ELCs)組的療效差異。體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。擴增培養(yǎng)后,取用3-6代的MSCs。在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(EGM-2)中加入50ng/ml的rVEGF164定向誘導(dǎo)M
3、SCs分化為ELCs。經(jīng)流式細胞儀、免疫細胞化學(xué)及免疫熒光鑒定。采用12周300克重左右的SD大鼠,經(jīng)球囊損傷大鼠右側(cè)頸總動脈制備頸動脈急性損傷模型。應(yīng)用20umol/L BrdU孵育48小時標記細胞。將大鼠模型分為3組,在手術(shù)當天,分別經(jīng)股靜脈移植數(shù)量為2×106/ml經(jīng)標記了BrdU的MSCs、ELCs及PBS。在移植后7天,14天及28天,采用小動物專用高分辨率超聲顯像儀觀察損傷頸動脈新生內(nèi)膜形成情況。隨后取材、連續(xù)石蠟及冰凍切片
4、,觀察損傷動脈病理組織形態(tài)學(xué)的變化以及應(yīng)用免疫組化及免疫熒光觀察MSCs的歸巢及分化。形態(tài)學(xué)觀察顯示,誘導(dǎo)后的MSCs可見類似內(nèi)皮細胞樣改變,并表達成熟血管內(nèi)皮細胞的表面標志vWF,CD31,CD34,VEGFR2。小動物超聲檢查顯示,術(shù)后14天經(jīng)MSCs體外誘導(dǎo)分化的ELCs組的內(nèi)膜-中層厚度(IMT)較PBS組及未誘導(dǎo)組明顯降低(0.10士0.02mm vs0.14士0.03mm vs0.13士0.02mm,p<0.01),在術(shù)后2
5、8天這種表現(xiàn)更為明顯(0.16±0.02mm vs0.22±0.04mm vs0.23士0.05,p<0.01)。術(shù)后28天,石蠟病理切片Masson染色顯示,移植ELCs組新生內(nèi)膜面積/中層面積(I/M ratio)較PBS組及未誘導(dǎo)組明顯減少(1.22±0.23 vs2.52±0.64 vs2.87±0.40,p<0.001)。免疫組化標記anti-BrdU顯示,在損傷動脈的外膜側(cè)有大量的歸巢細胞,尤以外膜滋養(yǎng)血管處為甚,滋養(yǎng)血管內(nèi)
6、亦可見移植細胞,其次為新生內(nèi)膜處,而血管中膜幾乎未見移植細胞,提示移植細胞的歸巢主要集中在損傷動脈的外膜部分,可能部分通過滋養(yǎng)血管到達新生內(nèi)膜部分。MSCs組在損傷動脈外膜側(cè)可見較多α-smooth muscle actin陽性的BrdU標記細胞,提示移植的MSCs在體內(nèi)可能分化為平滑肌樣細胞;而ELCs組則見較多CD31陽性移植細胞,提示體外分化的ELCs在體內(nèi)仍保持內(nèi)皮細胞特征。
二、原發(fā)性高血壓患者循環(huán)內(nèi)皮祖細胞、內(nèi)
7、皮功能及靶器官損害的研究
內(nèi)皮祖細胞(EPCs)為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,近年來發(fā)現(xiàn)循環(huán)EPCs與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系;血流介導(dǎo)的血管舒張功能(FMD)是反應(yīng)內(nèi)皮功能良好的檢查手段,內(nèi)皮功能障礙與高血壓的關(guān)系正日益受到重視。本研究通過觀察原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮功能及循環(huán)EPCs數(shù)量的改變,分析影響血管內(nèi)皮功能及EPCs的危險因素,并初步探討靶器官受累情況與內(nèi)皮功能不全及EPCs的關(guān)系。 本研究入選280名原發(fā)性
8、高血壓患者,其中男性175位,女性128位(59士8vs60±10歲)。根據(jù)2007年歐洲高血壓指南靶器官損害的診斷標準,按靶器官損害數(shù)量將高血壓患者分為4組:無靶器官損害組(n=61),1個靶器官損害組(n=113),2個靶器官損害組(n=59)及3個以上靶器官損害組(n=47)。高頻血管超聲檢測右上肢肱動脈內(nèi)皮依賴性(血流介導(dǎo)血管舒張,F(xiàn)MD)和非內(nèi)皮依賴性舒張功能(硝酸甘油介導(dǎo)血管舒張,NTG)。經(jīng)流式細胞儀檢測外周血CD133+
9、/KDR+細胞定義為EPCs。所有患者同時檢查頸總動脈內(nèi)膜一中層厚度(IMT),頸-股動脈脈搏波速度(cf-PWV)及左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。FMD功能與靶器官受累情況密切相關(guān)。原發(fā)性高血壓無靶器官損害組FMD為11.88±7.11%,伴1個靶器官損害組FMD為10.00士6.15%,較無靶器官損害組有明顯下降(p<0.01);2個靶器官損害組FMD7.37士5.02%,較1個靶器官損害組也有顯著下降(p<0.01);而3個以上靶器官
10、損害組(6.85±4.70%)較2個靶器官損害組的FMD稍有下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.7)。NTG在2個及3個以上靶器官損害組較無靶器官損害組均有顯著下降(8.31士5.42%vs12.57±7.60%,p<0.01;8.78士6.46%vs12.57±7.60%,p<0.01)。逐步多元回歸分析顯示,F(xiàn)MD與腰圍(β=-0.283,p<0.01),年齡(β=-0.231,p<0.05)及IMT(β=-0.197,p=0.05)明顯
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