骨折及軟骨損傷后干細(xì)胞遷移機(jī)制研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至小鼠長(zhǎng)干骨骨折部位促進(jìn)骨折愈合過程中遷移及修復(fù)的研究
　　一、目的:
　　本研究在建立小鼠股骨閉合型骨折模型的基礎(chǔ)上,觀察骨折后干細(xì)胞向骨折斷端歸巢的現(xiàn)象,研究干細(xì)胞歸巢后的轉(zhuǎn)歸及作用機(jī)制;觀察骨折后不同時(shí)間點(diǎn)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨折愈合的影響,為注射干細(xì)胞修復(fù)骨折提供臨床應(yīng)用參考。
　　二、方法:
　　1、設(shè)計(jì)制作設(shè)備,建立小鼠股骨閉合型骨折內(nèi)固定模型。
　　2、使用PCR方法

2、檢測(cè)小鼠骨折后趨化因子的表達(dá)時(shí)間變化。
　　3、建立 Transwell細(xì)胞遷移模型,檢驗(yàn)骨折組織勻漿對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的趨化作用,使用SDF-1/CXCR4軸特異性阻斷劑AMD3100檢驗(yàn)SDF-1的促遷移作用。
　　4、建立小鼠股骨閉合骨折內(nèi)固定模型,經(jīng)尾靜脈注射表達(dá)紅色熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使用熒光成像技術(shù)、冰凍切片及病理學(xué)方法觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否通過機(jī)體血液循環(huán)歸巢至骨折端,應(yīng)用免疫熒光和Western

3、-blot檢測(cè)方法檢查骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸,應(yīng)用 SDF-1的受體 CXCR4的特異性阻斷劑AMD3100進(jìn)一步驗(yàn)證SDF-1/CXCR4通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的動(dòng)員機(jī)制。
　　5、通過不同時(shí)間點(diǎn)向小鼠股骨閉合骨折內(nèi)固定模型行尾靜脈注射表達(dá)紅色熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使用熒光成像方法、Micro-CT、生物力學(xué)檢測(cè)尋找注射外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促骨折愈合的最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　三、結(jié)果:
　　1、成功自制閉合型骨

4、折制備器,建立可靠的小鼠股骨閉合型骨折內(nèi)固定模型。
　　2、小鼠骨折后0,3,7,14,28d骨折端組織提取物的趨化因子 SDF-1和MCP-3的mRNA表達(dá)均在7d達(dá)高峰, TGF-β1也在7天開始升高。
　　3、小鼠骨折后7d骨折斷端的組織勻漿可以在體外Transwell模型中促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移,該趨化作用可以被AMD3100阻斷。
　　4、小鼠骨折后7d尾靜脈注射表達(dá)紅色熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨折端

5、局部遷移,42d后仍能觀察到熒光細(xì)胞表達(dá)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到骨折端骨內(nèi)膜處,表達(dá)成骨相關(guān)因子OPN,OCN及趨化因子SDF-1。并促進(jìn)成骨相關(guān)因子BMP2,TGF-β1及VEGF的表達(dá)。術(shù)后14d及42d標(biāo)本取材固定后HE染色及Masson三色染色顯示骨折愈合明顯增快增強(qiáng)。骨折端組織對(duì)BMSCs的趨化作用,可以被SDF-1/CXCR4軸阻斷劑AMD3100阻斷。
　　5、術(shù)后7d在小鼠股骨閉合骨折內(nèi)固定模型行尾靜脈注射表達(dá)紅色

6、熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,熒光成像光密度值、BMD,BV,BVF,最大載荷,最大橈度,彈性橈度和剛度等指標(biāo)均優(yōu)于術(shù)后1d或14d。
　　四、結(jié)論:
　　1、自主研制的骨折制備器可成功模擬小鼠閉合性股骨固定。并行髓內(nèi)固定。觀察骨折愈合全過程,符合骨折軟骨內(nèi)成骨愈合進(jìn)程。
　　2、骨折端組織在第7d時(shí)主要趨化因子的表達(dá)都在高值。支持術(shù)后7d注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為最佳注射時(shí)機(jī)。
　　3、Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

7、說明SDF-1/CXCR4通路在促細(xì)胞遷移方面起到重要作用。
　　4、系統(tǒng)注射間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至骨折斷端骨內(nèi)膜處并長(zhǎng)時(shí)間增殖表達(dá),自身表達(dá)促成骨因子,也促進(jìn)旁分泌成骨因子,明顯促進(jìn)骨折愈合。 SDF-1/CXCR4通路在其中起到重要作用。
　　5、骨折術(shù)后7d注射間充質(zhì)干細(xì)胞較術(shù)后1d及14d為促進(jìn)骨折愈合最佳注射時(shí)機(jī)。
　　第二部分間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨損傷中遷移現(xiàn)象及機(jī)制的研究
　　一、目的:
　　研究軟骨

8、損傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨下骨下歸巢的現(xiàn)象及其可能機(jī)制。
　　二、方法:
　　1、制作大鼠股骨滑車直徑2mm,深1mm骨軟骨缺損模型。
　　2、術(shù)后向關(guān)節(jié)腔注射106/0.2ml表達(dá)紅色熒光蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　3、術(shù)后1、2、3、7d股骨髁取材,行冰凍切片,Hochest33258染色后在熒光顯微鏡下觀測(cè),觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分布。
　　4、術(shù)后3、7、14、21d,取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射組及生

9、理鹽水注射組關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜及髕下脂肪墊組織行蛋白芯片檢測(cè)。取股骨髁間軟骨缺損周圍4×4×2mm范圍骨軟骨組織,立即液氮下研磨后提取RNA行RT-PCR檢測(cè)趨化因子。
　　5、術(shù)后3m,待缺損纖維愈合后再次注射106/0.2ml骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。術(shù)后1、2、3、7d股骨髁取材,行冰凍切片,Hochest33258染色后在熒光顯微鏡下觀測(cè),觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分布。
　　三、結(jié)果:
　　1、缺損術(shù)后并注射RFP-BMSCs后

10、1、2d,BMSC出現(xiàn)在軟骨缺損區(qū)。3d后進(jìn)入軟骨下骨下骨髓腔,軟骨缺損區(qū)保留少。
　　2、缺損術(shù)后3m,缺損區(qū)纖維修復(fù)再次注射 RFP-BMSC后7d內(nèi)未見到RFP-BMSC遷移到缺損區(qū)及軟骨下骨區(qū)。
　　3、缺損術(shù)后并注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組3、7d關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜及髕下脂肪組織內(nèi)炎癥因子表達(dá)均高于未干預(yù)組。干細(xì)胞注射組軟骨缺損區(qū)周圍趨化因子表達(dá)也高于未干預(yù)組。
　　四、結(jié)論:
　　大鼠股骨髁軟骨全層缺損后注射骨髓