腫瘤的病理診斷基礎(chǔ)

1、檢測(cè)GISTs的抗體組合,,CD30,CD20,LMP-1,CD15,典型的霍奇金淋巴瘤,CD30,流式細(xì)胞分析術(shù)（ flow cytometry , FCM ）,原理 ：將懸浮在液體中分散的細(xì)胞微粒一個(gè)一個(gè)地依次通過檢測(cè)區(qū)，細(xì)胞流速可達(dá)9m/s,當(dāng)細(xì)胞通過微孔與激光呈垂直交匯時(shí)就可產(chǎn)生相應(yīng)的電脈信號(hào)，這些代表著多種熒光強(qiáng)度參數(shù)的電信號(hào)再經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理，得出相應(yīng)的供分析使用的點(diǎn)圖、直方圖和三維結(jié)構(gòu)圖。,DNA定量檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用癌前病

2、變的DNA倍體分析：異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志，應(yīng)用流式細(xì)胞分析癌前病變及不典型增生細(xì)胞的DNA含量，可協(xié)助診斷和鑒別不典型增生和早期癌;實(shí)體腫瘤DNA分析與預(yù)后的關(guān)系 .細(xì)胞凋亡檢測(cè)術(shù)：目前檢測(cè)凋亡常用的方法是DNA斷點(diǎn)的TUNEL和ISNT法，標(biāo)記DNA斷裂的3-羥基末端，可用直接或間接標(biāo)記法,3.癌基因定量技術(shù)：測(cè)定細(xì)胞Cyclin ( 周期蛋白 ) 對(duì)細(xì)胞周期起重要的調(diào)節(jié)作用，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定CyclinA、B、E、D

3、等以了解這些蛋白在細(xì)胞周期活動(dòng)中的變化及作用。此外還可檢測(cè)有些抑制細(xì)胞分裂作用的細(xì)胞周期蛋白，如P21、P16、P18、P27等，他們?cè)诩?xì)胞周期中也起著很重要的調(diào)節(jié)作用。多藥耐藥基因（multi-drug resistant gene,MDR）的表達(dá)產(chǎn)物P-170能將抗癌藥物排出細(xì)胞外，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以指導(dǎo)臨床用藥。,分子病理學(xué)技術(shù)在病理診斷和預(yù)后中的應(yīng)用,㈠．原位雜交（In situ hybridization ,ISH）：是一

4、種將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，它用標(biāo)記的DNA或RNA為探針在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。 ㈡．PCR技術(shù)： PCR是一種體外試管內(nèi)成百倍地特異性擴(kuò)增某一DNA片段，其長度一般小于1Kb。在加熱后使DNA雙鏈解鏈之后，用降溫的方法使兩條單鏈按堿基互補(bǔ)原理分別與加入的一對(duì)人工合成的寡核苷酸鏈引物結(jié)合。在耐熱的DNA聚合酶作用下反應(yīng)體系中的游離單核苷酸，在引物的引導(dǎo)下，以單鏈DNA為模板，按3ˊ－5ˊ端方向，合成

5、出兩條新的與模板DNA互補(bǔ)的子鏈。重復(fù)上述過程，可以使模板DNA以2 n的方式擴(kuò)增（n為循環(huán)次數(shù)）。,(三）原位PCR (in situ PCR )技術(shù) 實(shí)驗(yàn)材料：（1）懸浮細(xì)胞；（2）涂片細(xì)胞；（3）組織切片。1．直接法原位PCR ( direct in situ PCR ): 特點(diǎn)是使闊增產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子。操作簡(jiǎn)便，特異性較差，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且擴(kuò)增效率較低。2．間接法原位PCR ( indirect in situ

6、PCR )：主要步驟：標(biāo)本固定，目的是保持原有組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；滲入，即讓引物﹑核苷酸和酶等反應(yīng)液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；原位擴(kuò)增；原位雜交檢測(cè)，用特異性的標(biāo)記探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行原位雜交，然后再根據(jù)標(biāo)記分子的性質(zhì)用親和組織化學(xué)方法或免疫組織化學(xué)方法顯示其擴(kuò)增信號(hào)。,原位雜交、PCR、原位PCR的應(yīng)用：1．檢測(cè)內(nèi)源性基因⑴ 固有基因:機(jī)體細(xì)胞基因形態(tài)學(xué)上了解很少，原位PCR的問世，對(duì)基因的定位檢測(cè)提供了最敏感﹑最有效得手段。⑵ 異?；蜃儺惢?/p>

7、 ：基因突變都可以用原位PCR來進(jìn)行檢測(cè)和研究。2. 檢測(cè)外源性基因⑴ 感染基因：病毒基因——現(xiàn)在原位PCR正廣泛用于HBV﹑HIV﹑HPV﹑HSV等病毒性疾病的診斷及相關(guān)腫瘤的診斷及研究。細(xì)菌基因——用于某些細(xì)菌感染性疾病，如結(jié)核病及麻風(fēng)病的診斷。⑵ 導(dǎo)入基因：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或接受基因治療的患者，都可以用基因檢測(cè)的手段對(duì)外來基因進(jìn)行鑒別，并判斷基因?qū)胄颅h(huán)境后發(fā)生那些突變等。,生物芯片 1. 基因芯片 2.蛋

8、白芯片 3.組織芯片,圖像分析技術(shù)在腫瘤病理診斷與研究中的應(yīng)用,病理診斷和研究一般以定性或半定量描述為主，缺乏精確﹑客觀的量化指標(biāo)，不同觀察者之間，存在一定的主觀性及誤差，應(yīng)用多媒體圖像分析技術(shù)進(jìn)行形態(tài)測(cè)量分析，使形態(tài)量化，一定程度上解決了這個(gè)問題。圖像細(xì)胞術(shù)（imagecytometry ICM）,將二維平面的圖形結(jié)構(gòu)要素量化并進(jìn)行分析則；體視學(xué)（stereology ）。是由二維圖形結(jié)構(gòu)信息通過數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)公式的計(jì)算來推論

9、三維結(jié)構(gòu)信息的分析法 在腫瘤診斷與研究中，圖像細(xì)胞術(shù)主要測(cè)量三個(gè)方面的參數(shù)。即測(cè)量平面形態(tài)參數(shù)的ICM；測(cè)量光密度的DNA含量分析；測(cè)量呈色反應(yīng)產(chǎn)物（包括細(xì)胞化學(xué)﹑免疫組織化學(xué)及原位雜交）的ICM.。,㈠．圖像（形態(tài)定量）分析技術(shù) 1．良﹑惡性腫瘤的區(qū)別上的應(yīng)用 2．腫瘤的病理分級(jí)上的應(yīng)用 3．參數(shù)與腫瘤預(yù)后的評(píng)價(jià)㈡．圖像細(xì)胞光度技術(shù)（二）細(xì)胞核DNA倍體狀態(tài)的圖像分析：測(cè)量DNA 含量可作為診斷癌細(xì)胞的客觀依據(jù)。具有正

10、常DNA含量的細(xì)胞稱二倍體（diploid）,而惡性細(xì)胞由于其DNA含量與正常不同則稱為非整倍體或異倍體（aneuploid）.適用于各種標(biāo)本，包括印片﹑涂片﹑石蠟切片﹑冰凍切片﹑新鮮及組織消化后的細(xì)胞離心標(biāo)本，標(biāo)本采用Feulgen氏法染色，可長期保存及根據(jù)細(xì)胞學(xué)改變選擇測(cè)量對(duì)像等優(yōu)點(diǎn)，很適合病理腫瘤研究。有人對(duì)比流式細(xì)胞術(shù)與圖像細(xì)胞術(shù)，兩者結(jié)果相近或后者優(yōu)于前者。,激光掃描共聚焦顯微鏡在病理診斷中的應(yīng)用,激光掃描共聚焦顯微鏡（co

11、nfocal laser scanning microscope—CLSM）能通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)部進(jìn)行定位檢測(cè)，并可重建三維結(jié)構(gòu)模擬像直接對(duì)觀察對(duì)像的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。CLSM的主要結(jié)構(gòu)有：計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、激光照射系統(tǒng)、顯微鏡系統(tǒng)、X-Y平臺(tái)系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)等,用于以下幾方面的研究：①細(xì)胞、組織光學(xué)切片，三維圖像重建，并可將重見建圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)觀察；②對(duì)活細(xì)胞內(nèi)酸堿度及細(xì)胞離子的動(dòng)態(tài)定量測(cè)定觀察；③、細(xì)

12、胞骨架的構(gòu)成、生物膜結(jié)構(gòu)、和大分子組裝等的研究；④細(xì)胞間通訊的研究；⑤免疫熒光的定量分析；⑥細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定和光活化技術(shù)。,This is the microscopic appearance of a higher grade liposarcoma,At high magnification, the lipoblasts in this liposarcoma are visible.,This schwannoma was

13、 resected from a nerve. Note the circumscribed nature of this benign neoplasm.,A duble-layered cuboidal epithelium is demonstrated in the fibroadenosis,This is the histologic appearance of fibrocystic changes in breast