儀器分析07-3-液相色譜法

1、液相色譜法,Liquid Chromatography,簡介,最早發(fā)明的色譜法（俄國植物學家分離植物色素）直到1960年代后期才普及，因為受到材料和相應技術的限制實現(xiàn)了高速化，HPLC（high performance liquid chromatography or high pressure LC)和GC相比液體流動相選擇余地大，可以用以控制和改進分離條件通常在常溫下進行對象范圍大（80%的有機物）目前運用最廣最多的色

2、譜,1．高效液相色譜法與經典液相色譜法,高效液相色譜法比起經典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達 103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1

3、，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需1h之內即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內分離出尿中104個組分.,2．高效液相色譜法與氣相色譜法,（1）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質量大的物質，目前主要采用高效液相色譜法進行分

4、離和分析。 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。,(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經常可在室溫條件下工作。

5、 總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質，例如蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。,HPLC儀器,,HPLC和經典LC,Classic LC：重力洗脫,HPLC：高壓、

6、高效、高速,HPLC儀器組成,HPLC——高壓輸液系統(tǒng),高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性梯度淋洗裝置特別需要用于組分復雜、容量因子寬的樣品,HPLC——進樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓

7、的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：,HPLC——分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內徑1～6 mm，柱長5～40 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經沖洗后，即可備用。,HPLC——檢測器Detector,理想的HPLC檢測器要求靈敏度高對所有的溶質都有快速響應響應對流

8、動相流量和溫度變化不敏感不引起柱外譜帶擴展線性范圍寬使用范圍廣至今沒有一種檢測器能夠類似于GC中的TCD和FID，做到以上的這些要求。,在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。,HPLC——檢測器Detector,HPLC

9、——UV detector,紫外（可見）吸收檢測器：UVD應用最廣（70%）需要組分對紫外光（可見光）有吸收固定波長，可調波長，光電二極管陣列三類 特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm × 10mm ，容積 8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,HPLC——Fluorescence Detector,熒光檢測器（FD）選擇性濃度型高靈敏度，高選擇性

10、對象發(fā)射熒光的物質利用熒光試劑修飾的物質比UVD檢測靈敏度高2-3個數(shù)量級，達到10-12~10-13g/cm3可以梯度淋洗一般用于檢測多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等,HPLC——示差折光檢測器,differential refractive index detector通過連續(xù)檢測參比池和測量池中溶液的折射率（refractive index）的差別來測定濃度的。通用型檢測

11、器檢測的化合物范圍廣檢測靈敏度在10-7g/cm3缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗有反射、偏轉和干涉三種類型,HPLC——其他檢測器,電導檢測器選擇性檢測器在離子色譜儀中應用最多缺點是受溫度影響大，而且在pH>7時不靈敏蒸發(fā)激光散射檢測器根據(jù)不蒸發(fā)的溶質微小顆粒對激光的散射來檢測只跟溶質顆粒的大小和數(shù)量有關，與溶質的化學組成無光不能鑒別化學成分,HPLC中的固定相和流動相,stationary p

12、hase and mobile phase,Stationary phase 固定相,需要承受高壓，按承受高壓能力分剛性固體，以SiO2為基質，應用最廣泛，可以通過鍵合擴大應用范圍硬膠，由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成按孔隙深度分類表面多孔型：多孔層厚度小，孔淺，相對死體積小，出峰迅速柱效高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時迅速達平衡，適合做常規(guī)分析。但最大允許量受限。全多孔微粒型：由硅膠微粒凝聚而成。由于顆粒很細，孔

13、仍然較淺，傳質速率快，易實現(xiàn)高效、高速，適合復雜混合物分離及痕量分析。,Mobile phase 流動相,由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長

14、的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。,Mobile phase 流動相,（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產生“偽峰”。痕量雜質的存在，將使截止波長值增加50～1OOnm。（4）化學穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。（

15、5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離.,HPLC的主要類型和原理,Basic principle and main types,主要類型,液固吸附色譜液液分配色譜化學鍵合色譜尺寸排阻色譜親和色譜離子色譜,一、液固吸附色譜（LSAC）,液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常

16、是些多孔的固體顆粒物質，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質是根據(jù)物質在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。原理： X + nSad = Xad + nS,達平衡時,有其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。,LSAC——固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸

17、膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小。孔穴淺的優(yōu)點，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。,LSAC——流動相,一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試

18、樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強。表14-6列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。,二、液液分配色譜（LLPC）,在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。

19、分離原理： 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。,LLPC——固定相,由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β，β′一氧二丙睛，中

20、等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷等。為了更好解決固定液在載體上流失問題。產生了化學鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學鍵合固定相上進行的。,LLPC——流動相,在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個

21、基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。正向分配色譜：流動相的極性小于固定相的極性，用于分離極性化合物。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反向分配色譜：流動相的極性大于固定相的極性，用于分離非極性化合物。其流出順序與正相色譜恰好相反。,三、化學鍵合相色譜法（CBPC）,采用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度

22、淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分子成鍵,即可得到各種性能的固定相?；鶊F類型有：疏水基團：不同鏈長的烷烴和苯基等極性基團：醚和醇、氨丙基、氰乙基等離子交換基團：陰離子交換基團的氨基、季銨鹽；陽離子交換基團的磺酸基等,CBPC——固定相的制備,硅酸酯（≡Si一O

23、R）鍵合固定相 ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相?！許i－C或Si一N共價鍵合固定相共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反應不方便；當使用水溶液時，必須限制pH在4～8范圍內.,CBPC——固定相的制備,硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相這類鍵會

24、固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在70℃以下，PH=2～8范圍內正常工作，應用較廣泛.,CBPC——正相鍵合相色譜法,此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙晴.等）為流動相，分離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構

25、體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。,CBPC——反相鍵合相色譜法,此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相流動相是采用極性較強的溶劑它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。,四、尺寸排阻色譜法（SEC）,siz

26、e exclusion chromatography尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。廣泛應用于大分子的分級，具有其他LC法所沒有的特點：保留時間是分子尺寸的函數(shù)，可能提供分子結構的某些信息保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留

27、分子，因此柱壽命長。,SEC——分離原理（分子篩效應）,其固定相為化學惰性多孔物質——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內具有一定大小的孔穴體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內，最后洗出色譜柱。。,SEC——固定相,固定相凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，它是一種經過交聯(lián)而具有立體網狀結構的多聚體。 （1）軟性凝膠 如葡聚

28、糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 （2）半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。 （3）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相

29、，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。,SEC——流動相,排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。這對于具有低擴散系數(shù)的大分子物質分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃

30、、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。,五、親和色譜法（AC）,Affinity chromatography利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進行選擇性分離通常是在載體（無機或有機填料）表面先鍵合一種具有一般反應性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的

31、生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。,六、離子色譜法（IC）,Ion chromatography由離子交換色譜法派生出來，用于檢測分離離子性物質1975年Small等人實現(xiàn)的單柱離子色譜法（single column IC or non-suppressed IC）和雙柱離子色譜法（double column IC or suppressed IC）特點：分析速度快，檢測靈敏度高，選擇性好，多離子可以同時分

32、析，穩(wěn)定性高是離子性物質，特別是無機陰離子的最佳分離分析方法,IC——分類,按分離機理分成許多類，同時結合正相反相組成了更多種的離子色譜法。以下幾種為比較常用的：離子交換色譜法（ion exchange chromatography, IEC)電場相互作用+非離子性的吸附過程離子排斥色譜法（ion chromatography exclusion, ICE）Donnan膜平衡、體積排阻和分配過程離子對色譜法（ion pai

33、r chromatography, IPC）吸附與分配具體的介紹可以參考書本或其他的資料。,IC儀器的基本構成,以上為抑制型，，去掉抑制器、再生液和再生泵則為非抑制型,各種液相色譜法的比較,HPLC條件和類型的選擇,,影響HPLC分離效果的因素,在高效液相色譜中, 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項B/u較小，可以忽略不計，即： H = A + C u故液相色

34、譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。,影響HPLC分離效果的因素,流速大于0.5 cm/s時, H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時間的重要可選擇

35、參數(shù)。,氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。,分離類型的選擇,1．根據(jù)相對分子質量選擇 相對分子質量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標準液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質量范圍是20O～2000。對于相對分子質量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。,2．根據(jù)溶解度選擇

36、 弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水井屬于能離解物質，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。,3．根據(jù)分子結構選擇 用紅外光譜法，可預先簡單地判斷樣品中存在什么官

37、能團。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團及強氫鍵的用液一液分配色譜。,HPLC分離類型選擇,HPLC的應用,1. 環(huán)境中有機氯農藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 ～50?m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：5

38、0cm?2.5mm(內徑) 檢測器：差示折光檢測器,可對水果、蔬菜中的農藥殘留量進行分析。,2. 稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質。,固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 ºC 柱 壓：70 ?104 Pa 檢測器：紫外檢測器,超臨界流體色譜法

39、（SFC）,Supercritical fluid chromatography,超臨界流體色譜法,超臨界流體色譜法（Supercritical Fluid Chromatography ,SFC）是以超臨界流體作為流動相的一種色譜方法。所謂超臨界流體，是指既不是氣體也不是液體的一些物質，它們的物理性質介于氣體和液體之間。超臨界流體色譜技術是2O世紀80年代發(fā)展起來的一種嶄新的色譜技術。由于它具有氣相和液相所沒有的優(yōu)點，并能分離和分析氣

40、相和液相色譜不能解決的一些對象，應用廣泛，發(fā)展十分迅速。據(jù)估計，至今約有全部分離的25％涉及難以對付的物質，通過超臨界流體色譜能取得較為滿意的結果。,一．超臨界流體的特性,(1) 物質的臨界點 我們知道，某些純物質具有三相點和臨界點。純物質的相圖見圖20-s1由三相圖看出：物質在三相點下，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)。而在物質的超臨界溫度下，其氣相和液相具有相同的密度。當處于臨界溫度以上，則不管施加多大壓力，氣體也不

41、會液化。在臨界溫度和臨界壓力以上，物質是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會變化。此時的物質既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。臨界溫度通常高于物質的沸點和三相點。,,（2）超臨界流體的特性 超臨界流體具有對于分離極其有利的物理性質。它們的這些性質恰好介于氣體和液體之間。超臨界流體的擴散系數(shù)和粘度接近于氣相色譜，因此溶質的傳質阻力小，可以獲得快速高效分離。另一方面，其密度與液相色譜

42、類似，這樣就便于在較低溫度下分離和分析熱不穩(wěn)定性、相對分子質量大的物質。另外，超臨界流體的物理性質和化學性質，如擴散、粘度和溶劑力等，都是密度的函數(shù)。因此，只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質，從類似氣體到類似液體，無需通過氣液平衡曲線。超臨界流體色譜中的程序升密度相當于氣相色譜中程序升溫度和液相色譜中的梯度淋洗。 通常作為超臨界流體色譜流動相的一些物質，其物理性質列在表20-1中。,二．超臨界流體色譜儀,1985年出現(xiàn)

43、第一臺商品型的超臨界流體色譜儀。很多部分類似于高效液相色譜儀，但有兩點重要差別： （l）具有一根恒溫的色譜柱。這點類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對流動相的精確溫度控制。 （2）帶有一個限流器（或稱反壓裝置）。目的用以對柱維持一個合適的壓力，并且通過它使流體轉換為氣體后，進入檢測器進行測量。實際上，可把限流器看作柱末端延伸部分。,1.Berger p7500超臨界流體色譜儀,2.流程圖,3．壓力效

44、應,在SCF中，壓力的變化對容量因子k產生顯著影響，由于以超流體作為流動相，它的密度隨壓力增加而增加，而密度的增加引起流動相溶劑效率的提高，同時可縮短淋 洗時間。例如，采用CO2流體作流動相，當壓力由7.O×106Pa增加到9．0×106Pa時，對于十六碳烷烴的淋洗時間可由25min縮短到5min。在SFC中，通過程序升壓實現(xiàn)了流體的程序升密，達到改善分離的目的。,程序升壓與等壓譜圖比較,4.固定相和流動相,用

45、于SFC中的色譜柱可以是填充柱也可以是毛細管柱，目前，毛細管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有特別高的分離效率，倍受人們的青睞。 在SFC中，最廣泛使用的流動相要算是CO2流體，它無色、無味、無毒、易獲取并且價廉，對各類有機分子都是一種極好的溶劑。它在紫外區(qū)是透明的；臨界溫度31℃，臨界壓力7.29×106Pa；在色譜分離中，CO2流體允許對溫度、壓力有寬的選擇范圍。有時可在流體中引入1%～10%甲醇，

46、以改進分離的選擇因子α值。除CO2流體外，可作流動相的還有乙烷、戊烷、氨、氧化亞氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氫呋喃等。,5.檢測器,在高效液相色譜儀中經常采用的檢測器，如紫外、熒光、火焰光度等都能在SFC儀中很好應用。但SFC比起HPLC還具有一個主要優(yōu)點是可采用GC中火焰離子化檢測器（FID）。我們知道，F(xiàn)ID對一般有機物分析具有較高的靈敏度，這也就提高了SFC對有機物測定的靈敏.,三．超臨界流體色譜法與其他色譜法比較,（l）與高效

47、液相色譜法比較 實驗證明SFC法的柱效一般比HPLC法要高：當平均線速度為0.6cm·S-1時，SFC法的柱效可為HPLC法的3倍左右，在最小板高下載氣線速度是4倍左右；因此SFC法的分離時間也比HPLC法短。這是由于流體的低粘度使其流動速度比HPLC法快，有利于縮短分離時間。 （2）與氣相色譜法比較 出于流體的擴散系數(shù)與粘度介于氣體和液體之間，因此SFC的譜帶展寬比GC要??；另外，SFC中流動相的作用類似LC中

48、流動相，流體作流動相不僅載帶溶質移動，而且與溶質會產生相互作用力，參與選擇競爭。還有，如果我們把溶質分子溶解在超臨界流體看作類似于揮發(fā)，這樣，大分子物質的分壓很大，因此可應用比GC低得多的溫度，實現(xiàn)對大分子物質、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。,(3)HPLC與SFC范氏曲線比較,下圖描繪了SFC與其他色譜方法測定相對分子質量范圍的比較。由圖看出SFC比起GC法測定相對分子質量的范圍要大出好幾個數(shù)量級，基本與LC法相當。當然，尺

49、寸排阻色譜法（SEC）所測分子質量范圍是所有色譜法中最大的。 超臨界流體色譜法被廣泛應用于天然物、藥物、表面活性劑、高聚物、多聚物、農藥、炸藥和火箭推進劑等物質的分離和分析。,（4）應用范圍的比較,四.超臨界流體色譜的應用 application of SFC,1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m× 63μm i.d. 毛細管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動相：CO2