化學(xué)微生物學(xué)第5章生長(zhǎng)與控制

1、第五章 微生物生長(zhǎng)與控制,生長(zhǎng)——微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用>異化作用時(shí)，生命個(gè)體的重量和體積不斷增大的過(guò)程。繁殖——生命個(gè)體生長(zhǎng)到一定階段，通過(guò)特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過(guò)程。發(fā)育——從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、 從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過(guò)程，這一過(guò)程稱為發(fā)育。個(gè)體生長(zhǎng)——微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個(gè)體生

2、長(zhǎng)。群體生長(zhǎng)——群體中個(gè)體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓俊Ⅲw積、密度或濃度來(lái)衡量。（由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長(zhǎng)來(lái)反映個(gè)體生長(zhǎng)的狀況）個(gè)體生長(zhǎng)?個(gè)體繁殖? 群體生長(zhǎng) 群體生長(zhǎng) = 個(gè)體生長(zhǎng) + 個(gè)體繁殖,生長(zhǎng)與繁殖的概念,第五章 微生物的生長(zhǎng)與控制,第一節(jié) 微生物純培養(yǎng)分離及生長(zhǎng)測(cè)定 第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律 第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素 第四節(jié) 微生物生長(zhǎng)繁殖的控制,第一節(jié) 微生物純

3、培養(yǎng)分離及生長(zhǎng)測(cè)定,一、獲得純培養(yǎng)的方法,純培養(yǎng)(pure culture)——微生物學(xué)中把在實(shí)驗(yàn)室條件下從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng).單細(xì)胞：細(xì)菌、酵母菌等多細(xì)胞：絲狀真菌,首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個(gè)微生物.如果經(jīng)過(guò)稀釋后的大多數(shù)試管中沒(méi)有微生物生長(zhǎng),那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個(gè)微生物個(gè)體繁殖而來(lái)的純培養(yǎng)物.這種方法適合

4、于細(xì)胞較大的微生物.,①液體稀釋法,②平板劃線分離法（Streak Plate）,特點(diǎn)：快速、方便。 分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品） 連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）,,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.,連續(xù)劃線（左圖）,劃線分離后平板上顯示的菌落照片（右圖）,③傾注平板法（Pour Plat

5、e）,Organisms are serially diluted, then a small amount is added to an empty sterile petri dish, to which melted agar at 50 ºC is added. Then mix to distribute the organisms.,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,9ml,9ml,9ml,9ml,P

6、our plate,Pour plate,Pour plate,Pour plate,,④平板涂布分離法（Spread Plate）,簡(jiǎn)單易行，但易造成機(jī)械損傷,Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.,⑤選擇性培養(yǎng)分離法,為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)

7、條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。,＊利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離＊富集培養(yǎng),⑥單細(xì)胞（單孢子）分離法,采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來(lái)進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。,二、微生物

8、純培養(yǎng)生長(zhǎng)的測(cè)定方法,描述不同種類、不同生長(zhǎng)狀態(tài)的微生物生長(zhǎng)情況，需選用不同的測(cè)定指標(biāo)。（一）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)法直接法（血球計(jì)數(shù)板、比例計(jì)數(shù)法）間接法（活菌計(jì)數(shù)法、液體稀釋法、膜過(guò)濾法）（二）微生物生長(zhǎng)量和生理指標(biāo)測(cè)定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標(biāo)）,1.血球計(jì)數(shù)板法,原理：將1mm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)

9、胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對(duì)酵母菌可同時(shí)測(cè)定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。,血球計(jì)數(shù)板法原理,2.涂片染色法,應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適 于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。 方法：用鏡臺(tái)測(cè)微尺計(jì)算出視野

10、面積；取 0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代 入公式： 每ml原菌液含菌數(shù) =視野中平均菌數(shù)×涂布面積/視野面積 ×100 ×稀釋倍數(shù),3.平板菌落計(jì)數(shù)法,平板菌落計(jì)數(shù)法技術(shù)要求,★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無(wú)菌操作；★注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣

11、品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來(lái)源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作,★A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a sin

12、gle colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.,When we observe colonies, we cannot assume each arose from just one cell originally planted on the

13、 medium, however. A pair, chain or cluster of cells which 'land' on the medium in close proximity to each other can multiply and produce a single colony. Thus, we use the term colony-forming unit when we consider

14、 the common origin for the cells of any colony." This term is usually abbreviated CFU.,Colony-Forming Unit,4.液體稀釋法,10n,10n-2,10n-1,5.薄膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法,常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過(guò)薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過(guò)濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然

15、后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。,6.干重法,將一定量的菌液中的菌體通過(guò)離心或過(guò)濾分離出來(lái),然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12～10-13g。該法適合菌濃較高的樣品。舉例：大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細(xì)胞。,7.比濁法,原理

16、是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。,特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便；但易受干擾。,8.生理指標(biāo)法,測(cè)含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過(guò)測(cè)含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測(cè)

17、得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。,Table 1. Some Methods used to measure bacterial growth,第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律,一、微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng),由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長(zhǎng)存在著技術(shù)上的困難。同步生長(zhǎng)的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長(zhǎng)（

18、synchronous growth） ，進(jìn)行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。同步細(xì)胞群體在任何一時(shí)刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料,獲得同步生長(zhǎng)的方法,獲得同步生長(zhǎng)的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過(guò)濾、梯度離心。物理方法，隨機(jī)選擇，不影響細(xì)胞代謝。,Helmstetter-Cummings

19、 法,原理：一些細(xì)菌細(xì)胞會(huì)緊緊粘附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液通過(guò)微孔濾膜，細(xì)胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過(guò)濾膜，洗掉浮游細(xì)胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來(lái)的新生細(xì)胞，即為同步培養(yǎng)。,Figure 5.  The synchronous growth of a bacterial population.  By careful selection of cells that have j

20、ust divided, a bacterial population can be synchronized in the bacterial cell division cycle. Synchrony can be maintained for only a few generations.,Figure .synchronous growth,二、微生物的群體生長(zhǎng),☆無(wú)分支單細(xì)胞微生物主要包括細(xì)菌和酵母菌，其群體生長(zhǎng)

21、 是以群體中細(xì)胞數(shù)量的增加來(lái)表示的。 ☆ 由一個(gè)細(xì)胞分裂成為兩個(gè)細(xì)胞的時(shí)間間隔稱為世代，一個(gè)世代所需的時(shí)間就是代時(shí)（Ｇeneration time, G ），代時(shí)也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大一倍所需 時(shí)間，有時(shí)也稱為倍增時(shí)間。,☆右圖表示的是一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)若干代分裂后的情況。右圖可見(jiàn)，每經(jīng)過(guò)一個(gè)代時(shí)，細(xì)胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長(zhǎng)，這就是單細(xì)胞群體生長(zhǎng)的特征。,1.無(wú)分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)特征,,,,,By defin

22、ition, bacterial growth is cell replication – i.e., growth of the culture. Most species of bacteria replicate by binary fission, where one cell divides into 2 cells, the 2 cells into 4, the 4 into 8, etc. If this cell di

23、vision occurs at a steady rate – such as when the cells have adequate nutrients and compatible growing conditions – we can plot numbers of cells vs. time such as on the graph at right. Before too long, we will need to ex

24、tend the paper vertically as the population continues to double. For a culture where cells divide every 20 minutes, one cell can result in 16,777,216 (i.e., 224) cells after just 8 hours – barring nutrient depletion or o

25、ther growth-altering conditions.,1.無(wú)分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)特征,,If we were to convert our vertical axis to a logarithmic scale – as on the graph at right – we will not need as many sheets of graph paper, and we will find that a ste

26、ady rate of growth is reflected as a straight line. (On the vertical axis, the same distance on the paper is covered with each doubling.) This type of graph paper is called semilogarithmic graph paper on which we will be

27、 plotting our class results. The numbers we plot will fall on the graph at the same place the logarithms of these numbers would fall when plotted on conventional graph paper.,,The example at right shows the type of graph

28、 we may obtain from our class data. We can plot both colony-forming units (CFUs) per ml and absorbance on the same graph, remembering that the absorbance units should also be on a logarithmic scale. Rather than "con

29、necting the dots," we draw the best straight line among our CFU/ml plots to represent the phases of growth – lag, exponential, and the start of the maximum stationary phase.,指數(shù)生長(zhǎng)可以用下式表示：

30、b = B×2nB, b 和 t 可由試驗(yàn)獲得， n 可通過(guò)上式計(jì)算得出，將等式兩側(cè)取對(duì)數(shù)重排后得： lgb = lgB + nlg2 lgb - lgB lgb - lgB    lg2 0.301,式中：B 為起始時(shí)細(xì)胞數(shù)目， b 為指數(shù)生長(zhǎng)某個(gè)時(shí)刻 t 時(shí)的細(xì)胞數(shù)目， n 為世代數(shù),=,指數(shù)生長(zhǎng),n =,例如：一

31、培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開(kāi)始的12，000（ B ），經(jīng)4h （ t ）后增加到49，000，000（ b ），這樣， n ＝ (lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12,★借助于 n 和 t ，還可以計(jì)算出不同培養(yǎng)條件下的代時(shí)G， G ＝ t / n在本例中， G ＝4×60 / 12

32、＝20min∴該種微生物的代時(shí)為20分鐘。在4小時(shí)內(nèi)共繁殖了12代。,★代時(shí)能夠反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，代時(shí)短，生長(zhǎng)速率快，代時(shí)長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率慢。在很多微生物學(xué)研究中常常要了解微生物的代時(shí)?！锎鷷r(shí)在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時(shí)為1~3h,然而有些快速生長(zhǎng)的微生物的代時(shí)還不到10min,而另一些微生物的代時(shí)卻可長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)或幾天；另外，同一種微生物，在不同的生長(zhǎng)條件下其代時(shí)的長(zhǎng)短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時(shí)是恒

33、定的，因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。,一些細(xì)菌的代時(shí),Table . Generation times for some common bacteria under optimal conditions of growth.,不同溫度下的代時(shí),G (generation time) = t(time, in minutes or hours)/n(number of generations) G

34、= t/n G = generation time (time for the cells to divide) t = time interval in hours or minutes B = number of bacteria at the beginning of a time interval b = number of bacteria at the end of the time interval n = nu

35、mber of generations (number of times the cell population doubles during the time interval) b = B x 2n (This equation is an expression of growth by binary fission) G = t/n,Solve for n: n = logB + nlog2 n = logb - logB

36、            log2 n = logb - logB            .301 n = 3.3 logb/B G = t/n Solve for G G =    &#

37、160;   t        3.3 log b/B,Calculation of Generation Time,Example: What is the generation time of a bacterial population that increases from 10,000 cells to 10,000,000 cells in f

38、our hours of growth?,G =     t        3.3 log b/B G =    240 minutes        3.3 log 107/104 G =   240 minu

39、tes            3.3 x 3 G = 24 minutes,2.無(wú)分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)曲線,☆以細(xì)菌為例介紹無(wú)分支單細(xì)胞微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌?！钌L(zhǎng)曲線代表了細(xì)菌在新的環(huán)境中從開(kāi)始生長(zhǎng)、分裂直至死亡的整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。☆每種細(xì)菌都有各自的典型生長(zhǎng)曲線，但它們的生長(zhǎng)過(guò)程卻有著共同的規(guī)律性

40、。一般可以將生長(zhǎng)曲線劃分為四個(gè)時(shí)期。,將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長(zhǎng)數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。,生長(zhǎng)曲線的制作,典型的生長(zhǎng)曲線 （Growth curve）,延滯期,對(duì)數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期,時(shí)期的劃分：按照生長(zhǎng)速率常數(shù)（growth race constant）不同,一條典型的生長(zhǎng)曲線至少可以分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期

41、和衰亡期等四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期。,.,其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期1.現(xiàn)象：活菌數(shù)沒(méi)增加，曲線平行于橫軸。2.特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)= 0細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對(duì)外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）3.原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物,①延滯期（lag phase）,◆菌種 ： 繁

42、殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；◆接種物菌齡 ： 用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來(lái)說(shuō)， 接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；◆培養(yǎng)基成分： ◇在營(yíng)養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)短；◇接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長(zhǎng)，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。,★影響延遲期長(zhǎng)短的因素,認(rèn)識(shí)延遲期的特點(diǎn)及

43、形成原因?qū)?shí)踐的指導(dǎo)意義,◆在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期采取的縮短lag phase 的措施有：①增加接種量； （群體優(yōu)勢(shì)----適應(yīng)性增強(qiáng)） ②采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種◆在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌,②對(duì)數(shù)期（logarithmic phase）,其他名稱：指數(shù)期 現(xiàn)象：細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。

44、 特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)最大，即代時(shí)最短細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致代謝最旺盛細(xì)胞對(duì)理化因素較敏感影響因素：菌種營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)物濃度﹡培養(yǎng)溫度,應(yīng)用意義①由于此時(shí)期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長(zhǎng)該期，以達(dá)到較高的菌體密度③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期④是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。,營(yíng)養(yǎng)物濃度

45、與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量,作用方式：影響微生物的生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量生長(zhǎng)限制因子：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率和菌體產(chǎn)量的營(yíng)養(yǎng)物就稱生長(zhǎng)限制因子,細(xì)胞數(shù)或菌體量,③ 穩(wěn)定期（stationary phase）,,,又稱：恒定期或最高生長(zhǎng)期特點(diǎn)：①新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長(zhǎng)速率處于動(dòng)態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。②細(xì)胞分裂速度下降，開(kāi)始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開(kāi)始產(chǎn)芽孢。③此時(shí)期的微生物開(kāi)始

46、合成次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期。產(chǎn)生原因： 營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡 營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適; 有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等） 物化條件（pH、氧化還原勢(shì)等）不合適;,應(yīng)用意義：1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長(zhǎng)此期，提高產(chǎn)量，措施如下： 補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料） 調(diào)pH 調(diào)整溫度 2）穩(wěn)

47、定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。,生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長(zhǎng)得率，growth yield）：概念：表示微生物對(duì)基質(zhì)利用效率的高低 Y=菌體干重/ 消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度 根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要量 如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營(yíng)養(yǎng)物（葡萄 糖）10g。,,④ 衰亡期（decline phase）,,特點(diǎn)①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過(guò)新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急

48、劇下降，出現(xiàn)“負(fù)生長(zhǎng)”。②細(xì)胞內(nèi)顆粒更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開(kāi)始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)為向下跌落的趨勢(shì)。 衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長(zhǎng)，它的長(zhǎng)短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。產(chǎn)生原因生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過(guò)合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡,3.微生物生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系,微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過(guò)程與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程并不總是

49、一致的。一般認(rèn)為：,初級(jí)代謝是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過(guò)程，初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過(guò)程同步，微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時(shí)機(jī)；,,次級(jí)代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長(zhǎng)和繁殖無(wú)關(guān)。次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過(guò)程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長(zhǎng)穩(wěn)定期的后期或衰亡期。,4.絲狀微生物的群體生長(zhǎng),絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過(guò)斷

50、裂繁殖不形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)?？梢杂镁z干重作為衡量生長(zhǎng)的指標(biāo)，即以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。,可分為三個(gè)階段：1、生長(zhǎng)停滯期2、迅速生長(zhǎng)期3、衰退期,1、生長(zhǎng)停滯期: 造成生長(zhǎng)停滯的原因一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長(zhǎng)已經(jīng)開(kāi)始，但還無(wú)法測(cè)定。2、迅速生長(zhǎng)期:菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間呈直線關(guān)系，菌絲干重不以幾何級(jí)數(shù)增加，沒(méi)有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。生長(zhǎng)主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長(zhǎng)和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時(shí)期的菌體

51、呼吸強(qiáng)度達(dá)到高峰，有的開(kāi)始積累代謝產(chǎn)物。3、衰退期:菌絲體干重下降，到一定時(shí)期不再變化。大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物在此期合成，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。有些菌絲體還會(huì)發(fā)生自溶菌絲體，這與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)。,絲狀微生物的群體生長(zhǎng)分期,連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture）,分批培養(yǎng)（batch culture） ：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuo

52、us culture） ：在微生物培養(yǎng)的過(guò)程中，不斷地供給新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長(zhǎng)時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：由于對(duì)典型生長(zhǎng)曲線中穩(wěn)定期到來(lái)原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來(lái)臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。,原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，

53、使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長(zhǎng)期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率。,連續(xù)培養(yǎng)原理,按控制方式分按培養(yǎng)器的級(jí)數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分 按用途分,內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長(zhǎng)速率）：恒化器,單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器,一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器,實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐,,,,,,連續(xù)培養(yǎng)器,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng),概念：以恒定流速使?fàn)I

54、養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長(zhǎng)速率恒定的方法。 原理：通過(guò)控制某一種營(yíng)養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長(zhǎng)因子等） ，使其始終成為生長(zhǎng)限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。特點(diǎn)：維持營(yíng)養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長(zhǎng)速率。菌體生長(zhǎng)速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究,Figure .  Schematic diagram of a chem

55、ostat, a device for the continuous culture of bacteria. The chemostat relieves the environmental conditions that restrict growth by continuously supplying nutrients to cells and removing  waste substances and s

56、pent cells from the culture medium.,恒化器Chemostat 或bactogen,概念：通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過(guò)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來(lái)維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點(diǎn)：基質(zhì)過(guò)量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)

57、雜，煩瑣。,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng),使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。,恒濁器與恒化器的比較,連續(xù)發(fā)酵（continuous fermentation）,連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)酵而言。優(yōu)點(diǎn)：高效，簡(jiǎn)化了操作——裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作；自控：便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。缺點(diǎn)：菌

58、種易于退化；易于遭到雜菌污染；營(yíng)養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月~ 1年。,微生物與所處的環(huán)境之間具有復(fù)雜的相互影響和相互作用:一方面,各種各樣的環(huán)境因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和繁殖有影響,另一方面,微生物生長(zhǎng)繁殖也會(huì)影響和改變環(huán)境.研究環(huán)境因素與微生物之間的關(guān)系,可以通過(guò)控制環(huán)境條件來(lái)利用微生物有益的一面,同時(shí)防止它有害的一面.,第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素,影響微生物生長(zhǎng)的外界因素很多，除了前

59、面講過(guò)的營(yíng)養(yǎng)因素之外，還有許多物理化學(xué)條件。本節(jié)主要內(nèi)容：一、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響二、氧氣對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響三、pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響,幾個(gè)基本概念,滅菌（sterilization）采用強(qiáng)烈的理化因素是任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施，稱為滅菌。消毒（disinfection）采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被處理物體基本無(wú)害的措施，稱為消毒。防腐（a

60、ntisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐?；煟╟hemotheraphy）即化學(xué)治療。利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病院微生物的生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。,低溫利用4℃以下的各種低溫以保藏食物、藥品、菌種等。缺氧在密閉容器中加入除氧劑，如鐵粉。真空保藏也是比較常用的方法。干燥采用曬干或紅外線干燥保藏糧食、食品等，或在密封條件下用吸濕

61、劑也可達(dá)到防霉作用。高滲：通過(guò)鹽漬或糖漬達(dá)到高滲。高酸度：如泡菜、酸菜等。防腐劑：苯甲酸、山梨酸、脫氫醋酸等,防腐的措施,溫度是影響微生物生長(zhǎng)的最重要因素之一。溫度對(duì)微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞合成。影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，溫度高，流動(dòng)性大，有利于物質(zhì)的運(yùn)輸，溫度低，流動(dòng)性降低，不利于物質(zhì)運(yùn)輸，因此，溫度變化影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度，對(duì)生長(zhǎng)有影響。,一、

62、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響,從微生物整體來(lái)看生長(zhǎng)的溫度范圍一般在-10 ℃ ~100 ℃極端下限為-30 ℃，極端上限為105~300 ℃但對(duì)于特定的某一種微生物：只能在一定溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在這個(gè)范圍內(nèi)，每種微生物都有自己的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)，即最低、最適、最高生長(zhǎng)溫度,超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過(guò)低，甚至?xí)劳?。處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度最快，代時(shí)最短。超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過(guò)高，甚至?xí)劳觥?（一）

63、微生物生長(zhǎng)的三個(gè)溫度基點(diǎn),（二）微生物生長(zhǎng)溫度類型,低溫型微生物（嗜冷微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）,低溫型微生物最適生長(zhǎng)溫度在5~20℃,主要分布在地球的兩極、冷泉、深海、冷凍場(chǎng)所及冷藏食品中。例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長(zhǎng)，常引起冷藏食品的腐敗。嗜冷微生物在低溫下生長(zhǎng)的機(jī)理，目前還不清楚，據(jù)推測(cè)有兩種原因：①它們體內(nèi)的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失②細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含

64、量高，低溫下也能保持半流動(dòng)狀態(tài)，可以進(jìn)行物質(zhì)的傳遞。,中溫型微生物室溫型主要為腐生或植物寄生，在植物或土壤中；最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃ ~40 ℃ ，大多數(shù)微生物屬此類；體溫型主要為寄生，在人和動(dòng)物體內(nèi)。 高溫型微生物最適生長(zhǎng)溫度為50 ℃ ~60 ℃,主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。在高溫下能生長(zhǎng)的原因：①酶蛋以及核糖體有較強(qiáng)的抗熱性②核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成 氫鍵，增加熱穩(wěn)

65、定性 ）。③細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。,高溫微生物的特點(diǎn)生長(zhǎng)速度快，合成大分子迅速，可及時(shí)修復(fù)高溫對(duì)其造成的分子損傷。 耐高溫菌具應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在減少能源消耗、減少染菌、縮短發(fā)酵周期等方面具重要意義。,,★不同生理生化過(guò)程的最適溫度,微生物不同生理活動(dòng)要求不同溫度，所以， 最適生長(zhǎng)溫度 ≠ 發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多。,以青霉素的生產(chǎn)為例：培養(yǎng)165小時(shí)采用分段控制溫度的方法，其青霉素產(chǎn)量比始終在

66、30 ℃培養(yǎng)提高了14.7%。分段控制方式：0~5小時(shí)，30 ℃；5~40小時(shí)，25 ℃；40~125小時(shí)，20 ℃；125~165小時(shí)，25 ℃。,1、高溫對(duì)微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。★微生物對(duì)熱的耐受力與以下因素有關(guān):(1)微生物種類及發(fā)育階段 嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱有芽孢的細(xì)菌比無(wú)芽孢的菌抗熱微生物的繁殖結(jié)構(gòu)比營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)抗熱性強(qiáng)老齡菌比幼齡菌抗熱,（三）高溫與

67、低溫對(duì)微生物的影響,(2)微生物對(duì)熱的耐受力還受環(huán)境條件影響 與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)—— 培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高時(shí)比較耐熱.與pH 有關(guān)—— pH適宜時(shí)不易死亡，pH不適宜時(shí)，容易死亡.與水分有關(guān)—— 含水量大時(shí)容易死亡，含水量小時(shí)不容易死亡.與含菌量有關(guān) ——含菌量高，抗熱性增強(qiáng)，含菌量低，抗熱性差。與熱處理時(shí)間有關(guān)—— 熱處理時(shí)間長(zhǎng)，微生物易死亡。,當(dāng)環(huán)境溫度低于微生物的最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物的生長(zhǎng)繁殖停止，當(dāng)微生物的原生

68、質(zhì)結(jié)構(gòu)并未破壞時(shí)，不會(huì)很快造成死亡并能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持活力，當(dāng)溫度提高時(shí)，可以恢復(fù)正常的生命活動(dòng)。 低溫保藏菌種就是利用這個(gè)原理。一些細(xì)菌、酵母菌和霉菌的瓊脂斜面菌種通?？梢蚤L(zhǎng)時(shí)間地保藏在4℃的冰箱中。 當(dāng)溫度過(guò)低，造成微生物細(xì)胞凍結(jié)時(shí)，有的微生物會(huì)死亡，有些則并不死亡。,2、低溫對(duì)微生物的影響,造成死亡的原因①凍結(jié)時(shí)細(xì)胞水分變成冰晶，冰晶對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生機(jī)械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。②凍結(jié)過(guò)程造成細(xì)胞脫水

69、 凍結(jié)速度對(duì)冰晶形成有很大影響，緩慢凍結(jié)，形成的冰晶大，對(duì)細(xì)胞損傷大；快速凍結(jié)，形成的冰晶小、分布均勻，對(duì)細(xì)胞的損傷小，因此，利用快速凍結(jié)可以對(duì)一些菌種進(jìn)行凍結(jié)保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶、保護(hù)劑等可對(duì)菌種進(jìn)行長(zhǎng)期保藏。,微生物對(duì)氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群: 專性好氧菌: 好氧菌

70、 微好氧菌： 兼性厭氧菌 耐氧厭氧菌： 厭氧菌 (專性)厭氧菌：,二、氧氣對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響,,,,氧濃度對(duì)不同微生物生長(zhǎng)的影響,,專性好氧菌（strict aerobe）,必須在有分子氧的條件下才能生長(zhǎng)，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和過(guò)氧化氫酶。,