Pseudomonas putida DLL-E41,2,4,-苯三酚1,2-雙加氧酶的晶體結構及兩種農藥降解相關酶的蛋白質晶體學研究.pdf

1、微生物在污染環(huán)境的生物修復方面具有重要作用,它們對環(huán)境污染物的降解是通過一系列酶來進行的.因此,研究污染物降解過程中關鍵酶的作用機理,對于闡明微生物對污染物的生物降解過程以及生物修復機制具有重要意義。蛋白質晶體學是利用X-射線衍射技術對蛋白質的結構進行解析的一門學科,它能使我們從原子角度了解蛋白質的結構信息,結合蛋白質的功能特性,可以確定在實際催化過程中的功能基團及其作用方式,為定向改造提供重要信息.本文解析了4-硝基酚類污染物降解途徑

2、中涉及的1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶PnpC在兩種不同結晶條件下獲得的蛋白質晶體的三維結構,并對4-硝基酚類污染物降解過程中涉及的脫硝基酶PnpA,以及在除草劑阿特拉津降解中的脫氯酶AtzA進行了初步晶體學研究。
　　 對硝基苯酚(PNP)是一種重要化工原料,也是多種有機磷農藥降解的中間產物,進入環(huán)境的PNP會殘留在土壤和水體中,對動植物和人類的健康造成嚴重危害。PnpC和PnpA是甲基對硫磷降解菌Pseudomonas

3、putida DLL-E4代謝對硝基苯酚類污染物途徑中的兩個關鍵酶。PnpC作用于1,2,4-苯三酚的1,2位,使其開環(huán)形成馬來酰乙酸。
　　 通過Ni-NTA親和層析及Superdex-200分子篩對重組表達于E.coli BL21(DE3)pLysS中的PnpC進行純化,純酶使用坐滴氣相擴散法利用Hampton research結晶試劑盒對純PnpC進行結晶條件篩選,優(yōu)化并獲得了兩種不同結晶條件下的晶體.兩種結晶條件下所用蛋

4、白質濃度均為8 mg/mL,結晶池母液分別為:(Ⅰ)0.1 M Tris-HClpH7.5,1.3 M硫酸銨和(Ⅱ)0.1 M Hepes·pH7.5,0.8 M檸檬酸三鈉。以硫酸銨為沉淀劑結晶出的晶體用緩沖液溶解后仍具有酶活力,晶體能衍射到2.32(A),空間群為C121,晶胞參數為a=82.48,b=38.47,c=107.98,α=90.00°,β=118.06°,γ=90.00°；以檸檬酸三鈉為沉淀劑結晶出的晶體用緩沖液溶解后失

5、去酶活力,晶體能衍射到1.99(A),空間群為C121,晶胞參數為a=82.57,b=38.93,c=107.36,α=90.00°,β=118.05°,γ=90.00°。兩種條件下的晶體結構在每個不對稱空間中均只有一個分子,含水量均為46％。通過分子置換,利用來源于Nocardioides simplex3E中的1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶(PDB登記號:1TMX,40％一致性)的結構為模板,解析出這兩種不同結晶條件下晶體的三維

6、結構。
　　 PnpC的主體由6個較長α螺旋、7個β折疊及轉角組成,其主鏈走向與1TMX的主鏈走向一致。PnpC結構分為2個結構域:N端α螺旋結構域(NHD)和C端催化域(CCD),處于CCD的活性中心的四個氨基酸殘基分別為:TYR160、TYR194、HIS218以及HIS220,其中TYR160和HIS218處于同一個平面,并垂直于TYR194和HIS220所在的平面。PnpC的二聚體模型中,兩個單亞基NHD的H1、H3、H

7、4、H5、H6、H7互相作用構成二聚體的連接區(qū),而且在連接區(qū)的中心有一個疏水通道,有兩個長鏈磷脂分子貫穿疏水通道,它們的疏水尾部在通道的中心,親水區(qū)在疏水通道的外部。在兩個單亞基NHD組成的連接區(qū)里,一個亞基中的H1和另外一個亞基中的H6距離接近,兩個亞基的H3互相靠近并且反向平行,通道口由H3、H4及H7構成,H4、H5中的部分氨基酸殘基參與了通道的構成,H5、H7距離CCD的活性中心氨基酸接近。疏水通道主要由兩個亞基分別提供以下氨基

8、酸殘基組成:PHE28、ILE31、LEU35、LEU39、PHE42、LEU48、ILE57、PHE59、LEU60、LEU78、LEU82、ILE76以及ALA208。
　　 PnpC蛋白在兩種不同結晶條件下的結構的活性中心的四個氨基酸殘基之間的距離不同,以檸檬酸三鈉作沉淀劑的晶體結構中,TYR160和HIS218的距離為2.46(A),TYR194和HIS220的距離為4.23(A),而以硫酸銨作沉淀劑的晶體結構中,TYR

9、160和HIS218距離為2.33(A),TYR194和HIS220的距離為4.70(A)。它們的疏水通道中心的磷脂類尾部也有區(qū)別,檸檬酸三鈉結晶的晶體的結構該區(qū)域可能連接有一個benzo類似物,并且和兩個分子中的LEU35有作用,而以硫酸銨作沉淀劑的晶體結構中則沒有.
　　 利用 pET表達系統構建了表達從PnpC蛋白質序列N端開始,依次截短23、46以及64個氨基酸的三個表達質粒,并在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)

10、pLysS中對它們進行表達。它們的表達產物分別對應于從PnpC蛋白質的N端結構域中截去一個,兩個、三個組成連接區(qū)的較長α螺旋的突變體,這些表達產物均失去了催化1,2,4-苯三酚分解的能力。這表明,PnpC NHD的三個α螺旋對PnpC的催化能力是必需的。
　　 對硝基苯酚-4-單加氧酶(PnpA)是一個FAD依賴性單加氧酶,它在NADH和FAD存在下,通過加氧作用使PNP脫硝基生成苯醌。通過Ni-NTA親和層析以及分子篩對重組表

11、達于E.coli BL21(DE3)pLysS中的PnpA蛋白質進行純化。利用坐滴氣相擴散法在293 K初篩并優(yōu)化獲得一個PnpA的結晶條件:蛋白質濃度為10 mg/mL,結晶池母液為0.1 M Hepes pH7.0,15％PEG4000。該條件下長出的晶體能衍射到2.24(A),空間群為P212121,晶胞參數為:a=54.47,b=77.56,c=209.17,α:90.00°,β=90.00°,γ=90.00°。通過分子置換找出

12、了PnpA結構的部分主鏈。另外還采集到PnpA浸泡底物PNP、4-NC以及KI的衍射數據,而且浸泡KI的數據中檢測到有異常散射信號。
　　 阿特拉津是國內外使用時間長、使用量大的除草劑之一,它的使用已經造成了大面積的土壤、水體的污染。阿特拉津脫氯酶(AtzA)催化阿特拉津脫去氯原子,變成毒性較低的羥基阿特拉津。關于AtzA酶學以及生物修復方面的研究較多,但仍未有結構報道。從阿特拉津降解菌Pseudomonas sp.SA1中擴增

13、出阿特拉津脫氯酶基因atzA,構建表達載體 pET29b-atzA,在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中進行了高效表達,通過硫酸銨沉淀、離子交換、分子篩對其進行了純化,純酶在293K條件下使用懸滴氣相擴散法和坐滴氣相擴散法均能篩選到蛋白質晶體,優(yōu)化獲得的較穩(wěn)定結晶條件下,晶體能衍射到4(A),蛋白質濃度為10 mg/mL,結晶池母液為0.1M檸檬酸三鈉pH5.6、12％MPD以及13％PEG4000.
　　 綜上所述,本文解