細胞克隆形成實驗

1、正德利用厚生惟和細胞克隆形成實驗細胞克隆形成實驗當單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。每個克隆含有50以上的細胞，大小在0.31.0mm之間。集落形成率表示細胞的獨立生存能力。各種理化因素可能導致細胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過一定的實驗方法可以對細胞的克隆形成能力進行檢測。細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。

2、克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大：一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。實驗方法：實驗方法：平板集落形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗(a)平板集落形成實驗：本法適用于貼壁生長的細胞和正常培養(yǎng)的細胞(b)軟瓊脂集落形成實驗：本法適用于非錨著依賴性生長的細胞，如骨髓造血干細胞、腫瘤細胞株、轉化細胞系。

3、正德利用厚生惟和(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基(含有2抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中培養(yǎng)1

4、0～14天。(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆)將1.2％低熔點瓊脂糖與2細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6％的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固

5、，取對數期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并調細胞濃度為10000個ml，將0.6％低熔點瓊脂糖與2細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3％的上層瓊脂，每孔加1ml上層瓊脂和100ul單細胞懸液（約1000cellwell)，混勻，室溫凝固。置于37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2－3周，計數含50個細胞以上得克隆，計算細胞集落形成率，SpotII采集圖像。注意事項注意事項1.接種時細胞密度適度，不可過高。2.軟瓊脂與細