結(jié)核菌素純蛋白衍生物

1、結(jié)核菌素純蛋白衍生物結(jié)核菌素純蛋白衍生物JiehejunsuChundanbaiYanshengwuPurifiedProteinDerivativeofTuberculin(TB－PPD)本品系用結(jié)核分枝桿菌經(jīng)培養(yǎng)、殺菌、過濾除去菌體后純化制成的純蛋白衍生物，用于結(jié)核病的臨床診斷、卡介苗接種對象的選擇及卡介苗接種后機(jī)體免疫反應(yīng)的監(jiān)測。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。結(jié)核菌素純蛋白衍生物

2、（TBPPD）生產(chǎn)車間必須符合國家生物安全防護(hù)等級的要求，必須與其他生物制品生產(chǎn)車間及實(shí)驗(yàn)室分開原液生產(chǎn)全部過程，包括結(jié)核分枝桿菌的滅活，應(yīng)在完全隔離的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行所需設(shè)備及器具均須單獨(dú)設(shè)置并專用。直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃等器具，應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格清洗及滅菌處理。從事TBPPD生產(chǎn)的工作人員必須身體健康，經(jīng)X射線檢查無結(jié)核病，且每年經(jīng)X射線檢查1～2次，可疑者應(yīng)暫離該制品的制造。2制造制造2.1菌種生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)

3、程”的有關(guān)規(guī)定。2.1.1名稱及來源采用人型結(jié)核分枝桿菌CMCC93009（H37Rv）菌株。2.1.2種子批的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。2.1.3種子批的傳代自工作種子批至菌體收集傳代應(yīng)不超過12代。2.1.4種子批菌種的檢定2.1.4.1染色鏡檢菌體染色后鏡檢為短粗桿菌、微彎曲兩端圓、抗酸染色陽性。2.1.4.2生化反應(yīng)硝酸鹽還原、煙酸反應(yīng)、尿素酶應(yīng)為陽性，耐熱觸酶、聚山梨酯80水解應(yīng)為陰性（附錄ⅩⅣ

4、）。2.1.5種子批的保存凍干菌種保存于8℃以下，液體菌種保存于70℃以下。2.2原液2.2.1生產(chǎn)用種子取工作種子批菌種在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基或改良蘇通綜合培養(yǎng)基或其它適宜培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，以作為生產(chǎn)用種子。2.2.2培養(yǎng)基采用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、改良蘇通綜合培養(yǎng)基或經(jīng)批準(zhǔn)的其他培養(yǎng)基。2.2.3菌種接種和培養(yǎng)3.1原液檢定3.1.1外觀原液凍干品應(yīng)為白色疏松體。液體原液及凍干品復(fù)溶后應(yīng)呈棕黃色澄明液體，無不溶物或雜質(zhì)。3.1.2復(fù)溶時間凍

5、干品按標(biāo)示量加入注射用水后，應(yīng)于3分鐘內(nèi)完全溶解。3.1.3水分應(yīng)不高于3.0%（附錄ⅦD）。3.1.4純度3.1.4.1蛋白質(zhì)含量依法測定(附錄ⅥB第二法)。3.1.4.2多糖與核酸含量每1mg蛋白質(zhì)含多糖與核酸總量應(yīng)不高于0.1mg。（1）多糖含量測定：以生理氯化鈉溶液稀釋無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，制備0～100μgml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將硫酸225ml加入到75ml生理氯化鈉溶液中，另稱取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中，將上述溶液混合，配制

6、成蒽酮混合液。分別精確量取1.0ml不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液以及本品，加入4.0ml蒽酮混合液，混勻，置沸水浴20分鐘后于波長620nm處測定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對應(yīng)其吸光度，用minitab或其他統(tǒng)計學(xué)方法求回歸方程，代入本品吸光度，計算多糖含量。（2）核酸含量測定：取本品2～3ml，采用紫外－可見分光光度法（附錄ⅡA），于波長260nm處測定吸光度，按E1%1cm=200計算核酸含量。3.1.5效價測定3.1.5.1動物法將標(biāo)

7、準(zhǔn)品及本品分別稀釋3個不同稀釋度，至少取4只已經(jīng)結(jié)核菌致敏的體重為400～600g的白色雌性豚鼠，去毛后于背部脊柱兩側(cè)相對部位，分別皮內(nèi)注射上述稀釋度本品各0.1ml或0.2ml，于注射后24小時、48小時觀察局部硬結(jié)的縱徑與橫徑（可根據(jù)48小時的反應(yīng)結(jié)果判定）。計算每個稀釋度注射后2天的硬結(jié)反應(yīng)總和或平均面積，并求其比值，每個稀釋度本品與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的比值應(yīng)為0.8～1.2。如不符合上述要求，可調(diào)整稀釋度后再測定效價，直至符合要求。

8、3.1.5.2稀釋度選擇稀釋度的選擇應(yīng)能使本品注射后24小時所產(chǎn)生的局部硬結(jié)反應(yīng)直徑為8～25mm；本品和標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)直徑大小應(yīng)相似，且本品和標(biāo)準(zhǔn)品的3個稀釋度的劑量對數(shù)反應(yīng)線應(yīng)基本平行。如本品效價與標(biāo)準(zhǔn)品效價不一致，可用同樣方法復(fù)試1次，并算出相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品的效價，進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后再重新抽樣測定效價，直至符合要求。3.1.6無菌檢查依法檢查（附錄ⅫA）應(yīng)符合規(guī)定。3.1.7無有毒分枝桿菌試驗(yàn)（取消動物法）取1.0ml本品，分別接種于10