瘧疾快速診斷技術(shù)

1、瘧疾快速診斷技術(shù)的研究與應(yīng)用,湖北CDC傳染病所袁方玉,主要內(nèi)容,前言顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷熒光顯微鏡用于瘧疾診斷PCR方法用于瘧疾診斷免疫學(xué)用于瘧疾診斷 1、瘧疾診斷試劑基于的靶抗原 2、診斷試劑基于的免疫學(xué)原理 3、瘧疾診斷的快速診斷試劑,前言,瘧疾是廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣地區(qū)的一種重要蚊媒傳染病，弓l起世界范圍內(nèi)的較高的發(fā)病率和死亡率， 簡便、快速和可靠的檢測手段對提高臨床療效和控

2、制流行具有重要意義。傳統(tǒng)的厚、薄血膜姬氏染色鏡檢浩仍是當(dāng)前瘧疾診斷的主要方法，但費時費力，需專業(yè)培訓(xùn)人員，且對低原蟲血癥者易漏診 這些不足促進了更敏感、簡便，更快速的新技術(shù)的發(fā)展，如熒光染色鏡檢 組氨酸富集蛋白和瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原檢測及PCR技術(shù)等。,,世界衛(wèi)生組織召開的專家研討會上認(rèn)為瘧疾的診斷方法應(yīng)準(zhǔn)確、敏感、低廉快速方法應(yīng)能檢出每微升100個原蟲，檢測時間應(yīng)在1小時內(nèi)完成檢測。,一、顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷,顯微鏡鏡檢仍

3、是目前廣泛應(yīng)用的瘧疾診斷技術(shù)(金標(biāo)準(zhǔn)）主要優(yōu)點 - 特異高 - 能區(qū)分蟲種 - 能分期 - 能計數(shù) - 1小時內(nèi)能完成診斷程序,,缺點要求有較高的技術(shù)素質(zhì)容易漏檢（惡性瘧）大規(guī)模鏡檢費時、費力敏感性低（原蟲感染率為0.01%，厚片的敏感性是薄片的10倍）,二、 熒光顯微鏡用于瘧疾診斷,研究發(fā)現(xiàn)，一些熒光素對核酸有好的親 和力，經(jīng)一定波長的紫外線激活，原蟲核酸可通過熒光顯微鏡觀察到。目前常用的熒光染色劑

4、:有吖啶橙（AO）苯并硫羥基嘌呤（bcp）若丹明-123一種紅色的熒光染料，主要作用于細胞膜，也常用于原蟲染色,FIG. 1. Trophozoites of P. falciparum stained with AO in the QBC UV fluorescence method,,吖啶橙（AO）優(yōu)缺點： 染色需要較高的技術(shù)，辨認(rèn)非特異性著色因子，特別注意區(qū)分豪厄爾斯氏體同原蟲的區(qū)別，這種豪厄爾斯氏體來自溶血

5、性貧血的病人。一般來說，吖啶橙染色法檢測原蟲的敏感性為41-93%,為﹥100原蟲/1微升血液,相當(dāng)于0.002%感染率。檢測惡性瘧的特異性為93%。檢測間日瘧和其他非惡性瘧原蟲的后期原蟲的特異性只有52%。,,ｂｃｐ染色優(yōu)缺點： ｂｃｐ染色后瘧原蟲厚血膜在４００倍熒光顯微鏡下見，瘧原蟲各發(fā)育期及滋養(yǎng)體、裂殖體和配子體呈特異性蘋果綠色熒光；胞槳瘧色素呈黃色；白細胞胞槳染成亮綠色。血膜中的異物不呈熒光色，易區(qū)別。,FIG.

6、2. Trophozoites of P. falciparum stained with BCP in the fluorescence method.,,,ｂｃｐ染色惡性瘧與間日瘧血片，敏感性為９７．４％、９１．２％，特異性為６６．７％、５０％，陽性預(yù)測值９７．６％、８８．６％陰性預(yù)測值５０％與４０％。認(rèn)為ｂｃｐ染色法是一種有使用價值的瘧疾診斷新方法。,,若丹明-123： 一種紅色的熒光染料，主要作用于細胞膜，也常用于

7、原蟲染色 ，目前用得不多。,三、PCR方法用于瘧疾診斷,PCR方法嚴(yán)格來說不能算是瘧疾的快速診斷方法，他的主要特點是敏感性高，能檢出每微升少于5個原蟲的血液樣本。復(fù)式、多層和熒光定量PCR方法可用于瘧疾的定性和定量診斷，這對哪些形態(tài)學(xué)難以鑒別的樣本來說非常有價值。,,（一）瘧原蟲檢測的常用的分子標(biāo)志 有環(huán)子孢子 (CS)、18SrRNA片段、裂殖子表面蛋白一1(Msp一1)、裂殖子表面蛋白一2(Msp一2)及富組氨酸

8、蛋白(m )基因等,,CS是瘧原蟲子孢子表達的一種期特異性表面抗原的基因。已發(fā)現(xiàn)通過測定CS基因序列的重復(fù)結(jié)構(gòu)可進行瘧原蟲分類．了解其遺傳特征和地理來源。自1984對CSP基因序列進行測定以來，已積累了大量CSP基因資料，至今為止有中美洲、南美洲、東亞、東南亞、南太平洋島嶼開展間日瘧原蟲CSP基因序列分析．問日瘧原蟲CSP中央重復(fù)區(qū)由15—21個9肽重復(fù)單位組成，每單位由27個核苷酸編碼9個氨基酸，目前已發(fā)現(xiàn)兩類明顯不同的9肽重復(fù)單位，

9、分為Pv—I型和PV一Ⅱ型．I型按9肽單位氨基酸序列變化分為溫帶族和熱帶族，兩族序列差異明顯．分布有一定局限性。,,（二）優(yōu)缺點：PCR方法也可用于研究原蟲的種群差異、突變和對藥物的抗性 敏感性高。能夠檢測到感染率為0.00001%的惡性瘧原蟲血樣，以及感染率為0.0000126%的間日瘧血樣。利用套式和逆轉(zhuǎn)錄PCR方法能鑒定4種瘧原蟲，,,一般PCR方法也存在著產(chǎn)物的污染易致假陽性，不能在一次檢測中鑒別蟲種，也不能診斷混合感染。

10、 需特殊設(shè)備，不能用于現(xiàn)場費時，成本高,四、免疫色譜方法,（一）原理 免疫色譜技術(shù)其原理為利用硝酸纖維素膜(NC)制備免疫層析測試條，在NC上包被被檢抗原的一株單抗作為捕獲帶，同時，將另一株單抗偶聯(lián)在膠體金或乳膠上作為檢測試劑。當(dāng)樣本溶液和檢測試劑通過捕獲帶時，二者形成的復(fù)合物即被包被在膜上的抗體捕捉，如果樣品中含有被檢抗原，則捕獲帶可發(fā)生顏色反應(yīng)，顏色反應(yīng)的強弱與樣本中的抗原濃度成正比。這些產(chǎn)品從取血、反應(yīng)、結(jié)

11、果判斷，只需5—10分鐘，而且多個樣本可同時進行檢測不需特殊儀器，非常適合于邊遠山區(qū)基層醫(yī)院、衛(wèi)生所防保醫(yī)生和村醫(yī)應(yīng)用。,FIG. 3. Principle of immunochromatographic RDT for malaria,,,（二）瘧疾診斷試劑基于的靶抗原1、水溶性蛋白HEP（histidine-rich proteins）。研究表明惡性瘧原蟲感染紅細胞后，由感染的紅細胞分泌三種含有大量組氨酸組成的水溶性抗原，它們是

12、HRP-1/HRP-2和HRP-3。HRP-2由感染瘧原蟲的紅細胞大量分泌，其含量在整個紅細胞內(nèi)期隨裂殖子的分裂逐漸升高。這一抗原只由無性體中和早期配子體產(chǎn)生，量大，且較穩(wěn)定，是用于惡性瘧診斷的首選。同HRP-1和HRP-2比較，HRP-3在血液中的量很少，目前還沒有針對它的試劑盒,,2、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH) 乳酸脫氫酶是糖酵解途徑的終止酶，由瘧原蟲的無性期和有性期產(chǎn)生。先

13、前的研究揭示了pLDH同宿主動物L(fēng)DH在理化、免疫學(xué)特性和酶學(xué)方面有很大的差異。另外四種瘧原蟲產(chǎn)生的pLDH有不同的異構(gòu)體，具有種、屬特異性，因而目前將它作為快速檢測試劑第二選擇的靶抗原。,,3、醛縮酶（aldolase） 醛縮酶是一種果糖二磷酸醛縮酶，可催化1，6-二磷酸果糖，生成磷酸二羥丙酮及磷酸甘油醛，由瘧原蟲的無性期和有性期產(chǎn)生。四種瘧原蟲都能檢測到。一些研究建議將此酶作為快速診斷的靶抗原，目前僅限于研究。,,

14、（三）快速診斷試劑1、ParaSight-F。ParaSight-F法為世界衛(wèi)生組織推薦的應(yīng)用產(chǎn)品，檢測原蟲的靶抗原為HRP-2。和厚血膜鏡檢比較，現(xiàn)場評估結(jié)果顯示在原蟲密度大于100個／微升，原蟲感染率0.002%時，檢測惡性瘧的敏感性平均為77～98%，特異性83～98%。當(dāng)患者HRP-2分泌少，血液中HRP-2水平低時，ParaSight-F法可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，同PCR法比較，ParaSight-F的檢測低感染率患者的敏感性低于

15、PCR法。,,2、ICT pf和 PATH Falciparum Malaria IC。ICT pf。 ICT pf （ICT1）診斷卡用于檢測惡性瘧，也是基于檢測HRP-2抗原。該診斷試劑由于操作簡單，所需儀器少，結(jié)果易于判斷，贏得了越來越多的使用者。缺點是只能檢測惡性瘧，如果用于檢測其他瘧疾可能造成漏檢或誤診；其次不能用于診斷混合感染；第三有報道于內(nèi)風(fēng)濕因子起交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性。,FIG. 4. Amrad ICT

16、 Pf immunochromatographic test device for detection of P. falciparum HRP-2.,,,3、OptiMAL。 OptiMAL診斷試劑是基于檢測原蟲代謝產(chǎn)物乳酸脫氫酶，目前OptiMAL乳酸脫氫酶檢測試劑盒是在層析條上包被兩株LDHpf單抗，一株為惡性瘧種特異性單抗，另一株為能與四種人瘧原蟲都反應(yīng)的屬特異性單抗。此診斷方法在實驗室和現(xiàn)場條件下都已進行了評估，同鏡

17、檢法相比，惡性瘧原蟲的敏感性和特異性在分別為88％和99％ ，問日瘧分別為94％ 和100％。在評估中也發(fā)現(xiàn)，感染率小于0.002%的血樣OptiMAL檢測有3%的陰性,FIG. 5. OptiMAL immunochromatographic test device for the detection of pLDH.,,TABLE 1. Results of routine blood samples examined for ma

18、laria by microscopy compared to OptiMAL rapid dipstick testa,No. of samples and species present by microscopyNo. OptiMAL positive Sensitivity (%

19、)Plasmodium falciparum    54 with parasitemia of >1% (50,000 parasites/µl)54 100    103 with parasitemia of 0.1–1%

20、 (5,000 parasites/µl)103 100    72 with parasitemia of 0.01–0.09% (500 parasites/µl)72

21、 100    32 with parasitemia of 0.001–0.009% (50 parasites/µl)23 72    11 with parasitemia of 0.0001–0.

22、0009% (5 parasites/µl)8 73    5 with gametocytes only 4

23、 80Plasmodium vivax    110 (all asexual stages) 105 96Plasmodium malari

24、ae    17 (late trophozoites) 8 47Negative    214 (no malaria para

25、sites found)0 100,TABLE 2. Results obtained by microscopy and OptiMAL from sequential blood samples from 60 patients

26、 receiving therapy for P. falciparum malariaa,,,TABLE 3. Comparison of methods for diagnosing Plasmodium infection in blood,,,五、鏡檢站、鏡檢中心的職責(zé)和任務(wù),1、如何確定每個縣血檢數(shù)A 國家規(guī)定，以縣為單位發(fā)病率在1/萬以上的地區(qū)，（我們省棗陽、襄陽、老河口、廣水一類縣）年血檢數(shù)不低于轄區(qū)人口總數(shù)

27、的2%;B 1/萬以下的地區(qū)，年血檢率不低于轄區(qū)人口總數(shù)的1%（二類縣、區(qū)）；C 連續(xù)三年無本地瘧疾病例的縣，年血檢率不低于轄區(qū)人口總數(shù)的2/‰（三類縣）。,‰,,2、鏡檢站 省衛(wèi)生廳要求（鄂衛(wèi)函【2010』365號），各級綜合醫(yī)療單位、傳染并醫(yī)院及鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院都要建立門診發(fā)熱病人瘧原蟲鏡檢站，有1-2名專職化驗人員承擔(dān)門診發(fā)熱病人血檢瘧原蟲工作。鏡檢員有以下幾件職責(zé)：（1）采血、制片

28、、染色、鏡檢（2）編號登記（3）保留好血片（4）按要求上報血檢報表,,3、鏡檢中心 省衛(wèi)生廳要求縣、市、區(qū)級疾病控制中心都要成立鏡檢中心，其鏡檢中心的職責(zé)為：（1）督導(dǎo)檢查所轄鏡檢站工作（2）指導(dǎo)、培訓(xùn)鏡檢站鏡檢員（3）負(fù)責(zé)對各鏡檢站的陰、陽性血片進行復(fù)核?？h級鏡檢中心負(fù)責(zé)復(fù)核所轄鄉(xiāng)鎮(zhèn)全部陰性片的5%,地市級鏡檢中心抽查所轄縣市區(qū)復(fù)查陰性片的10%，省級復(fù)查各市抽查陰性片的20%，陽性片全部復(fù)查。,,（4）地市級