科室講座

1、流式細(xì)胞術(shù)在白血病中的臨床應(yīng)用,新疆自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科莫紅梅,一、簡(jiǎn)介流式細(xì)胞術(shù)二、簡(jiǎn)介白血病三、流式細(xì)胞術(shù)在白血病中的應(yīng)用(結(jié)合病例分析),一、簡(jiǎn)介流式細(xì)胞術(shù),1.流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）：以流式細(xì)胞儀測(cè)量懸浮細(xì)胞的一種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。綜合運(yùn)用電子、激光、計(jì)算機(jī)和流體力學(xué)等與熒光標(biāo)記、分子免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的生理功能和特性進(jìn)行分析。,散射光信號(hào),Right A

2、ngle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC,

3、 Side Scatter）細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性,Laser,FALS Sensor,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào),熒光信號(hào)使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,熒光信號(hào),雙色直接染色,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,二、簡(jiǎn)介白血病,造血干細(xì)胞分化過(guò)程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。,1.白血病：常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,根據(jù)白

4、血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程：,急性：原始細(xì)胞、早期幼稚細(xì)胞為主，自然病程僅數(shù)月慢性：較成熟幼稚細(xì)胞和成熟細(xì)胞為主，自然病程常為數(shù)年,淋系、髓系（單核和粒細(xì)胞）急淋、急非淋（急性髓系白血?。┞堋⒙?根據(jù)主要受累的細(xì)胞系可分：,2、白血病的病因,放射因素化學(xué)因素病毒因素遺傳因素其它血液病：慢粒、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓纖維化、MDS、PNH、淋巴瘤、MM,3、發(fā)病率,占癌癥發(fā)病率的5%，我

5、國(guó)發(fā)病率2-4/10萬(wàn)，美國(guó)9.6/10萬(wàn)，歐洲4.3-9.0/10萬(wàn)。,我國(guó)白血病的流行現(xiàn)狀及特點(diǎn),急性：慢性5.5：1急性髓系白血病最多，其次急淋、慢粒，慢淋少成人急白以急粒為多見(jiàn)兒童以急淋為多見(jiàn)慢粒白血病隨年齡增長(zhǎng)發(fā)病率逐漸升高慢淋在50歲以后才明顯增多男性略高于女性1.18：1,現(xiàn)有的分型：,FAB1976年形態(tài)分類1985-1986MIC:MorphologyImmunolog

6、y Cytogenetics WHO1995-1997細(xì)胞遺傳學(xué)NCI1990,FAB1991年修訂：急性髓系白血病,M0 急性髓系白血病微分化型M1急性粒細(xì)胞白血病未分化型M2急性粒細(xì)胞白血病部分分化型M3急性早幼粒細(xì)胞白血病M4急性粒單核細(xì)胞白血病M5急性單核細(xì)胞白血病M6紅白血病M7急性巨核白血病,急性淋巴細(xì)胞白血病,B細(xì)胞系T細(xì)胞系,4、臨床特點(diǎn),起?。喊l(fā)病急驟或緩慢起病急者

7、往往可沒(méi)有前驅(qū)癥狀，突然發(fā)病，以發(fā)熱、多部位出血、進(jìn)行性蒼白或骨、關(guān)節(jié)疼痛等為首發(fā)癥狀。起病緩慢者以蒼白、乏力、虛弱和食欲減退等癥狀開(kāi)始，可進(jìn)行性加重，以后多有發(fā)熱、出血等。,發(fā)熱是最常見(jiàn)癥狀。感染原因：中性粒細(xì)胞減少或缺乏；中性粒細(xì)胞功能異常；免疫功能尤其是細(xì)胞免疫功能低下，或化療、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用；白血病細(xì)胞在全身各臟器廣泛浸潤(rùn)，尤其是高白細(xì)胞浸潤(rùn)后使組織缺氧，局部組織出血、壞死，增加了細(xì)菌滋生機(jī)會(huì)?？股氐氖褂貌?/p>

8、正確，尤其是條件致病菌及真菌的感染,發(fā)熱和感染,急白：幾乎所有患者都有不同程度出血，其中以M3和M5出血重。慢性白血病:不常見(jiàn)原因：血小板質(zhì)和量異常DIC :M3易發(fā)生凝血因子缺乏,出血,原因：骨髓中紅細(xì)胞系的造血被白血病細(xì)胞增殖所替代或受到白血病細(xì)胞分泌的抑制因子所抑制，使骨髓中紅細(xì)胞的生成減少，并使幼稚紅細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞生成素的反應(yīng)減弱。無(wú)效紅細(xì)胞生成；幼稚紅細(xì)胞增生異常。溶血：多見(jiàn)于ALL、CLL,急白合并DIC時(shí)常有

9、微血管病性溶血。其它：急慢性失血及某些抗代謝化療藥物,貧血,白血病細(xì)胞大量繁殖，使骨髓內(nèi)張力增高而發(fā)生疼痛；白血病細(xì)胞也可浸潤(rùn)骨皮質(zhì)和骨膜，發(fā)生局部腫塊，還可以引起骨皮質(zhì)破壞缺損引起疼痛；白細(xì)胞壞死引起高尿酸血癥致痛風(fēng)、融骨性粒細(xì)胞肉瘤等，均可引起骨痛。肢體劇烈疼痛多見(jiàn)于ALL,兒童白血病多浸潤(rùn)關(guān)節(jié)，成人主要疼痛部位在胸骨、肋骨及脊椎等。,骨、關(guān)節(jié)疼痛,神經(jīng)系統(tǒng)白血病細(xì)胞?？汕旨爸袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，以蛛網(wǎng)膜及硬腦膜的浸潤(rùn)常見(jiàn)。,

10、消化系統(tǒng)消化道的出血常見(jiàn),肝、脾、淋巴結(jié)腫大急白的淋巴結(jié)腫大多為表淺的輕度腫大，質(zhì)地較軟，多局限在頜下、頸部、腹部及腹股溝等處。絕大多數(shù)T-ALL有縱膈淋巴結(jié)的腫大，但較少引起氣管、頸靜脈壓迫等癥狀。巨脾主要見(jiàn)于CML晚期及其急變、幼淋巴細(xì)胞白血病。,呼吸系統(tǒng)肺部浸潤(rùn)以AML多見(jiàn)，侵犯胸膜發(fā)生胸腔積液以ALL多見(jiàn)，亦可見(jiàn)于AML-M5,多為血性，可見(jiàn)較多白血病細(xì)胞。,泌尿系統(tǒng),心臟五官及口腔白血病細(xì)胞浸潤(rùn)口

11、腔黏膜可引起牙齦腫脹增生、巨舌、牙齦出血及口腔潰瘍，以AML-M4和M5最常見(jiàn)；眼眶與球后為綠色瘤的好發(fā)部位。乳腺 綠色瘤 常見(jiàn)于兒童和青年AML患者，尤以M2b多見(jiàn)，少數(shù)以綠色瘤為首發(fā)。綠色瘤浸潤(rùn)之處皆呈綠色，是由于含大量的過(guò)氧化物酶所致。,電解質(zhì)紊亂低鉀血癥是AML于ALL常見(jiàn)的并發(fā)癥，于溶菌酶增高有關(guān)，血及尿中溶菌酶增高損傷腎小管，使近曲小管功能不全，鉀離子排出增多。低鈉血癥高鉀血癥低鈣血癥

12、高磷血癥,3.流式細(xì)胞免疫分型的發(fā)展史,1968年——第一臺(tái)流式細(xì)胞儀 美國(guó)斯坦福大學(xué)80年代中期——MIC分型我國(guó)：1988年——北京大學(xué)人民醫(yī)院購(gòu)入1990年——白血病免疫分型臨床應(yīng)用,二、FCM在白血病診斷、治療中的應(yīng)用,白血病分型是白血病的診斷、選擇化療方案、判斷預(yù)后的重要依據(jù),外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,1.CD45的臨床應(yīng)用,CD45是白細(xì)胞的共同抗原成分。其分子量介于180—22

13、0Kda之間，屬于T200家族。所有人類白細(xì)胞均表達(dá)CD45，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞、嗜酸、嗜堿性細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、扁桃腺細(xì)胞以及骨髓前體細(xì)胞。,造血系統(tǒng)細(xì)胞CD45表達(dá)量與細(xì)胞分化程度的高低緊密相關(guān),即：分化程度高的細(xì)胞CD45表達(dá)量高，分化程度低的細(xì)胞CD45表達(dá)量低（淋巴細(xì)胞>單核細(xì)胞>成熟粒細(xì)胞>原幼細(xì)胞，在紅細(xì)胞中不表達(dá)；SSC是側(cè)向角參數(shù)，反應(yīng)細(xì)胞的顆粒度（成熟粒細(xì)胞>單核細(xì)胞>

14、;原幼細(xì)胞>淋巴細(xì)胞）。目前，國(guó)際上采用CD45—SSC設(shè)門（Gating），可非常輕松地將白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞分開(kāi)，增加白血病免疫分型的準(zhǔn)確性,正常人骨髓有核細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖,2.FCM在白血病中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),▲能正確區(qū)別AML和ALL，并能進(jìn)一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型▲能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M6、M7▲診斷雙系或雙表型白血病▲發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)個(gè)別次要非本系列相關(guān)抗原的白血病▲診斷少見(jiàn)疑難白血?。ㄈ鏗CL）

15、,正常BM各系細(xì)胞比率,淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;單核2-6%粒細(xì)胞:40-60%有核紅:20-25%,急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）R2：95.15%，CD33,HLA-DR,CD19,CD22,CD10 陽(yáng)性,,正常B細(xì)胞標(biāo)志,泛B標(biāo)志：CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22幼稚B標(biāo)志：CD34,TdT,CD10成熟B標(biāo)志：CD23,FMC7,B-ALL的分

16、型,2個(gè)月后復(fù)查:R3:73.94%CD33,HLA-DR,CD19, CD22,CD10,CD34陽(yáng)性,R2：15.14%CD33,HLA-DR,CD19,CD10,CD34,CD22陽(yáng)性，部分細(xì)胞表達(dá)CD20,,急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖,,正常T細(xì)胞標(biāo)志：根據(jù)在胸腺內(nèi)發(fā)育階段分類,T-ALL的分型,預(yù)后,B-ALL及急性早期B前體細(xì)胞白血病的預(yù)后差，C-ALL的預(yù)后較好。T細(xì)胞系A(chǔ)LL的預(yù)后一般

17、講，小兒T細(xì)胞系A(chǔ)LL預(yù)后較差，而成人此型的預(yù)后較好。染色體分析對(duì)ALL尤其是兒童ALL有重要的預(yù)后價(jià)值?；旌闲虲LL預(yù)后及治療效果比CLL差。,正常單核細(xì)胞標(biāo)志,全單核細(xì)胞標(biāo)志：CD33,CD13,HLA-DR幼稚單核細(xì)胞標(biāo)志：CD34,CD117成熟單核細(xì)胞標(biāo)志：CD14,CD64,正常人骨髓有核細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖,正常粒細(xì)胞標(biāo)志,成熟粒、單核細(xì)胞主要區(qū)別,成熟粒細(xì)胞：CD33+ HLA-DR- CD14- CD64+di

18、m成熟單核細(xì)胞：CD33++ HLA-DR+ CD14+ CD64++,R2:48.18%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD14,CD64,CD11b,CD13陽(yáng)性，部分細(xì)胞表達(dá)CD117,,R3:44.36%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD117,CD38,CD13陽(yáng)性,,病例一,某男，49歲，漢，以“咳嗽、咳痰、氣短40天”為主訴入院。血常規(guī)：WBC:33.5×109/L, HB

19、 62g/L,RBC 1.87×1012/L PLT:51×109/L, N 4.3%, L 90% M 5.4%,骨髓白血病免疫分型結(jié)果：,R1:98.80%陽(yáng)性表達(dá)：CD33:87.36%, CD13:46.67%, CD38:22.68% CD34:92.49% , HLA-DR:83.99%,, CD19:98.08%, CD10:58.70% , CD20:34.09%, CD22:54.92%,

20、,骨髓形態(tài)：有核細(xì)胞增生活躍，粒系增生受抑制，紅系增生活躍，淋巴細(xì)胞增生明顯活躍，占81%，其中原始及幼稚淋巴細(xì)胞分別占10%和58%。,治療一個(gè)療程(長(zhǎng)春地辛+去甲氧柔紅霉素+地塞米松)后復(fù)查骨髓免疫分型,R2:83.14%陽(yáng)性表達(dá)：CD33:99.53%, CD13:56.26%, CD38:24.47% CD34:98.44% , HLA-DR:99.68%,, CD19:99.39%, CD10:99.42% , CD2

21、0:54.47%, CD22:84.24%,,第二個(gè)療程加用阿糖胞苷，2個(gè)月后復(fù)查骨髓免疫分型（急性白血病雙表型）,,,,,病例二,某男，21歲，哈族，以“間斷發(fā)熱，伴頭暈、乏力一個(gè)月”為主訴入院。查體：重度貧血貌，右側(cè)腹股溝處觸及2個(gè)0.5*1cm大小淋巴結(jié)，邊清，活動(dòng)可，質(zhì)中，無(wú)壓痛，余（-）T：39.6℃，WBC: 1.3×109/L, HB 73g/L, PLT:94×109/L,,骨髓免疫分型,形態(tài)

22、：有核細(xì)胞增生極度活躍，粒系增生極度活躍，占96%，以異常早幼粒細(xì)胞增生為主。診斷：M3a,6個(gè)月后復(fù)查：,,急性早幼粒細(xì)胞白血病（AML-M3）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖,某男，73歲，漢，以“發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸部淋巴結(jié)腫大1周”為主訴入院。血常規(guī)：WBC:6.49×109/L, HB 80g/L, PLT:214×109/L, N 57.1%, L 33.4% M 7.9% , IgM 32.3g/L,病例三,骨髓白血

23、病免疫分型結(jié)果：,R1：61.41%陽(yáng)性表達(dá)：CD19, CD22,HLA-DR, CD20, CD38,FMC-7, CD23, CD5,病理結(jié)果：B小淋巴細(xì)胞淋巴瘤注意與其它慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病的鑒別,病例四：多毛細(xì)胞白血病,典型為外周血全血細(xì)胞減少，脾大。血涂片中細(xì)胞具有明顯的特征：為中等大小的淋巴細(xì)胞，核/質(zhì)比中等。胞質(zhì)亮藍(lán)，邊緣不清，具有細(xì)且不規(guī)則的“毛”狀胞質(zhì)突起。,,R2:14.60%CD19,CD103,C

24、D20,CD22,HLA-DR,FMC-7,CD23,CD25陽(yáng)性,診斷白血病主要標(biāo)志：,B-ALL: CD34, HLA-DR, CD19, CD10+/-, cCD79aT-ALL: CD34, CD38, CD7, CD2+/-, CD5+/-, cCD3AML: CD34, CD117, CD33, CD13, cMPO M2: CD19+: t(8, 21) M3: CD34-, HLA-DR- M4/

25、M5: CD14+ M6: GlyA+, CD71+ M7: IIb/IIIa(CD41, CD61)+,免疫分型對(duì)下列情況具有重要意義,用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來(lái)源的白血病。形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型對(duì)粒-單核細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細(xì)胞白血病。微小殘留白血病。,原始細(xì)

26、胞≥90%，胞漿大多透亮或中度嗜堿，無(wú)嗜天青顆粒及Auer小體，核仁明顯，類似All-L2型；細(xì)胞化學(xué)過(guò)氧化物酶及蘇丹黑B染色<3%；CD33或/及CD13陽(yáng)性。淋系抗原陰性，但可有CD7+、TdT+；電鏡過(guò)氧化物酶陽(yáng)性。,M0,原粒細(xì)胞（Ⅰ+Ⅱ 型） ≥90%(NEC), 早幼粒細(xì)胞很少，中幼粒細(xì)胞以下階段不見(jiàn)或罕見(jiàn)。,M1,M2,M2a 骨髓中原粒細(xì)胞為30%-10%M2b骨髓中原粒、早幼粒細(xì)胞增多，以異常的中

27、性中幼粒細(xì)胞增生為主，其胞核常有核仁，有明顯的核漿發(fā)育不平衡，此類細(xì)胞>30%.,M3,以顆粒增多的異常早幼粒細(xì)胞增生為主，>30%(NEC),其胞核大小不一，胞漿中有大小不等的顆粒：M3a 粗顆粒型M3b 細(xì)顆粒型,M4,,M5,M5a 未分化型：骨髓中原單核細(xì)胞Ⅰ+Ⅱ（NEC) ≥80%M5b 部分分化型：骨髓中原始+幼稚單核細(xì)胞（NEC)>30%，原單核細(xì)胞Ⅰ+Ⅱ<80%,M6,骨髓中紅細(xì)胞系&g

28、t;50%，且有形態(tài)學(xué)異常，骨髓原粒細(xì)胞（NEC）或原始+幼稚單核細(xì)胞（NEC）Ⅰ+Ⅱ型>30%；若血片中原粒細(xì)胞或原單核細(xì)胞>5%,骨髓原粒細(xì)胞或原始+幼稚單核細(xì)胞>20%(NEC),M7,外周血中有巨核細(xì)胞；骨髓中原巨核細(xì)胞≥30%，該原巨核細(xì)胞應(yīng)有電鏡或單克隆抗體證實(shí)；骨髓細(xì)胞少，往往干抽，活檢有原始和巨核細(xì)胞增多，網(wǎng)狀纖維增加。,關(guān)于雙系與雙表的定義,雙表型：白血病細(xì)胞均一，每個(gè)細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)淋巴系細(xì)胞及髓系細(xì)