離體大鼠肝臟灌流液蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、離體大鼠肝臟灌流是一項(xiàng)廣泛應(yīng)用于肝臟生理功能研究的技術(shù)，在合適的灌流條件下，灌流肝臟可在一定的時(shí)間窗內(nèi)保持結(jié)構(gòu)完整。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有大規(guī)模、高通量的特點(diǎn)。本論文第一部分將這兩種技術(shù)結(jié)合，嘗試在器官水平上全面完整地研究肝臟的分泌功能。在該類型研究中，主要有兩大問(wèn)題：一是如何保持肝臟器官的結(jié)構(gòu)完整，二是控制灌流液中的血污染。我們一方面調(diào)整并控制了器官灌流條件來(lái)減少灌流損傷和降低血污染，另一方面以灌流液中的谷_內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶量來(lái)評(píng)判肝臟損傷情況，

2、以灌流液中的免疫球蛋白IgG量作為灌流液血污染程度的指標(biāo)。我們選取谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平較低和肉眼觀沒(méi)有明顯血污染的灌流液進(jìn)行了后續(xù)研究。同時(shí)Western Blot和后續(xù)的質(zhì)譜鑒定均顯示灌流液中的IgG水平較低，提示灌流液中血污染較少。
　　 應(yīng)用二維毛細(xì)管液相色譜（強(qiáng)陽(yáng)+反相）與質(zhì)譜聯(lián)用方法，在鑒定假陽(yáng)性率約1％的基礎(chǔ)上，共獲得了886個(gè)灌流液蛋白鑒定。在這些蛋白中有423個(gè)蛋白被Swiss-Prot注釋，其中分泌蛋白的比例相對(duì)于肝

3、臟全組織蛋白組數(shù)據(jù)有高達(dá)5倍的富集；在富集指數(shù)方法富集的部分，分泌蛋白的比例則有約10倍的富集。應(yīng)用信號(hào)肽預(yù)測(cè)方法和富集指數(shù)方法，我們共獲得357個(gè)可能分泌蛋白，其中有49個(gè)非經(jīng)典途徑分泌蛋白被富集指數(shù)方法以較高可信度富集。在這些分泌蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)有71個(gè)蛋白參與信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中61個(gè)蛋白在胞外發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)這些蛋白的功能分析，我們實(shí)現(xiàn)了在器官水平和蛋白質(zhì)組學(xué)廣度上研究肝臟分泌功能。
　　 灌流液含有在灌流條件下器官水平的

4、組織間隙液蛋白，其富含疾病標(biāo)志物。正常大鼠肝臟灌流液蛋白中胞內(nèi)蛋白部分為肝臟灌流損傷所致。在這些蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)許多蛋白有文獻(xiàn)報(bào)道與損傷相關(guān)或已為肝臟損傷標(biāo)志物。我們認(rèn)為在離體器官灌流液中尋找潛在的標(biāo)志物而在血液或尿液中進(jìn)行驗(yàn)證，可能是尋找疾病標(biāo)志物的較好策略。在論文的第二部分，我們建立了Walker-256腫瘤細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)比較模型組與對(duì)照組之間的離體大鼠肝臟灌流液的差異，獲得了該腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移后肝臟灌流液中的差異蛋白。結(jié)果顯示