高級生物化學實驗報告-豬血中超氧化物歧化酶（sod）的分離純化及活力測定

1、高級生物化學實驗報告高級生物化學實驗報告實驗一實驗一豬血中超氧化物歧化酶（豬血中超氧化物歧化酶（SOD）的分離純化及活力測）的分離純化及活力測定一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一種能專一地清除超氧離子自由基（O2）的金屬酶，它具有抗衰老?？馆椛洹⒖寡卓拱┑茸饔?，因而在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)等方面具有了廣泛的應用前景。SOD是一種酸性蛋白，對熱、pH和蛋白酶的水解較一般酶穩(wěn)定。按照它所含金屬離子的不同，可分為CuZnSOD、MnSOD、

2、FeSOD等三種。CuZnSOD為二聚體，呈藍綠色；MnSOD呈紫紅色；FeSOD呈黃褐色。SOD催化下述反應：2H2O2→H2O2O2。機體內(nèi)O2的過量和不足均對機體不利，SOD對過量的O2的及時清除保證了機體內(nèi)的含量的相對平衡。機體內(nèi)O2的形成可分為生理性和病理性兩方面。在一些正常生理過程中會形成一些O2。例如：呼吸鏈中電子傳遞結果可產(chǎn)生一些O2。在某些疾病（如氬中毒、輻射病等）過程中會產(chǎn)生大量的O2。過量的O2如不及時清除，會對細

3、胞損傷。SOD將O2歧化為H2O2，而過氧化氫（物）酶、谷胱甘肽過氧化酶可催化過氧化氫分解，在機體內(nèi)形成一套解毒系統(tǒng)，對機體起防護作用。本實驗采用有機容易沉淀法以新鮮豬血為原料，從中提取SOD并進行純化。酶活力測定可用以下方法：鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶法、NBT光還原法、化學發(fā)光法、腎上腺素自氧化法、亞硝酸法等。該實驗SOD酶活性采用鄰苯三酚自氧化法測定，酶活性單位定義為：每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量

4、定義為一個酶單位。樣品中蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍G250法測定。考馬斯亮藍G250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結合呈現(xiàn)藍色。在一定范圍內(nèi)，溶液在595nm波長下的光密度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定，測定范圍11000μg。SOD同工酶鑒定采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術分離鑒定。用“負”10%過硫酸銨（Ap）：稱取過硫酸銨10g，溶于100ml重蒸水中，用時現(xiàn)配；○2’點擊緩沖液：稱取三是用現(xiàn)配羥甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。

5、用蒸餾水○3溶解并定容至1000ml。用時稀釋10倍。30%的AcrBis溶液：稱Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水溶解，定容至100ml，○4過濾后裝入棕色瓶，4℃保存；TrisHCl，pH8.9緩沖溶液：Tris（三羥甲基氨基甲烷）36.6g，加○51molLHCl48ml，TEMED0.4ml，用濃鹽酸調(diào)pH8.9后，再用蒸餾水定容至100ml；TrisHCl，pH6.7緩沖溶液：Tris（三羥甲基氨基甲烷）6.0g，加○61

6、molLHCl48ml，TEMED0.4ml，用濃鹽酸調(diào)pH6.7后，再用蒸餾水定容至100ml；NBT溶液：核黃素（0.01%），氯化硝基四氮唑藍（NBT）（25molL），磷酸緩○7沖液（0.05molL、pH7.8），EDTANa2（1.0molL）2.8X103molL的EDTANa2（用pH7.83.6X103molL磷酸緩沖液配置）○8【器材】752分光光度計，分析天平，具塞試管，刻度吸管（1ml，5ml），離心機，燒杯（5

7、0ml），電泳裝置一套，微量進樣器，注射器。三、操作步驟1.SOD的提取[1]取新鮮豬血20ml（預先按0.15:1（VV）的比例加入ACD抗凝劑）于50ml離心管，4000rm，10min離心，去上層血漿，取下層紅血球粘稠液，然后加入2倍體積的0.9%NaCl溶液清洗，4000rm，10min離心，棄上層清液，再加入2倍體積的0.9%NaCl溶液重復清洗一次，4000rm，10min離心，得洗凈的紅血球粘稠液。[2]向洗凈的紅血球中加