rna生物合成

1、RNA生物合成,轉(zhuǎn)錄,【目的與要求】,1、掌握轉(zhuǎn)錄的概念與特點(diǎn)2、掌握并能敘述原核生物與真核生物中RNA聚合酶的組成及功能3、掌握RNA轉(zhuǎn)錄過程4、掌握mRNA,tRNA與rRNA轉(zhuǎn)錄后加工過程,DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的比較,相同點(diǎn),模 板 兩股鏈均復(fù)制 模板鏈轉(zhuǎn)錄合成方式 半保留復(fù)制 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄原 料 dNTP NTP聚合酶 DNA聚合酶

2、 RNA聚合酶堿基配對(duì) A-T，G-C A-U，T-A，G-C產(chǎn) 物 半保留的雙鏈DNA 單鏈RNA,,不同點(diǎn),以DNA為模板遵循堿基配對(duì)原則都需依賴DNA的聚合酶聚合過程都是生成磷酸二酯鍵新鏈合成方向?yàn)?’→3’,,概 述,一、RNA的生理功能    DNA將攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)到RNA分子中，RNA分子以其信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成 二、

3、RNA合成概況    在生物界，RNA合成有兩種方式：一是DNA指導(dǎo)的RNA合成，此為生物體內(nèi)的主要合成方式。另一種是RNA指導(dǎo)的RNA合成，此種方式常見于病毒。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本是RNA前體（RNA precursor），需經(jīng)加工過程（processing）方具有生物學(xué)活性,第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄,一、轉(zhuǎn)錄:由DNA指導(dǎo)的RNA合成,DNA以堿基互補(bǔ)原則，決定合成RNA的全部堿基成分及排列順序，將DNA模板上

4、的遺傳信息傳遞到RNA分子的過程 1、反應(yīng)體系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+ ，合成方向5‘→3’。連接方式--- 3‘ , 5’磷酸二酯鍵 2、特點(diǎn)：不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄---DNA片段轉(zhuǎn)錄時(shí)，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，這種轉(zhuǎn)錄方式稱作不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄,模板鏈及反意義鏈：指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈為模板鏈，又稱反意義鏈     編碼鏈及有意義鏈：不作為轉(zhuǎn)錄的另一條DNA鏈為編

5、碼鏈，又稱有意義鏈 由于基因分布于不同的DNA單鏈中，即某條DNA單鏈對(duì)某個(gè)基因是模板鏈，而對(duì)另一個(gè)基因則是編碼鏈,5’…G C A G T A C A T G T C…3’3’…c g t c a t g t a c a g…5’,DNA,,5’…G C A G U A C A U G U C…3’,mRNA,,N… Ala Val His Val …C,多肽鏈,轉(zhuǎn)錄,翻譯,,編碼鏈,,模板鏈,不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄:

6、模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上,3、原料：四種磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中變?yōu)閁 4、合成過程: 連續(xù)，方向：5'→3'5、合成部位：細(xì)胞核內(nèi),二、原核RNA聚合酶,組成：RNA聚合酶由5個(gè)亞基構(gòu)成，α2ββ‘σ為全酶（分子量為480kD ）， α2ββ’為核心酶作用：識(shí)別DNA分子中轉(zhuǎn)錄的起始部位。 促進(jìn)與模板鏈結(jié)合，并使DNA雙鏈打開17bp。 催化NTP的聚合，完成一條RNA鏈

7、的聚合反應(yīng)。識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，停止聚合反應(yīng)，參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,,核心酶：能與DNA鏈結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但沒有特異性，轉(zhuǎn)錄出來的可能不是一個(gè)完整的基因序列,決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性,亞基,,分子量,,每分子酶中所含數(shù)目,,功能,,α,36512 2,β,150618 1,與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān),β′,155613 1,結(jié)合DNA模板,σ,70263 1,辨認(rèn)起始位點(diǎn),,,,原核RNA

8、聚合酶各個(gè)亞基的作用,特 點(diǎn),1. 聚合速率慢，30-85NTP/秒2.缺乏外切酶活性,無校對(duì)功能，錯(cuò)誤率10-63.不同的σ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子 4.可被藥物抑制（利福平） 人的RNA聚合酶對(duì)利福平不敏感。利用此特點(diǎn)可研制殺菌藥物,三、真核RNA聚合酶,真核較原核的酶復(fù)雜，已清楚的有RNA PolⅠ,Ⅱ,Ⅲ及Mt四型組成和功能：均由多亞基構(gòu)成，聚合酶Ⅱ主要負(fù)責(zé)mRNA的合成； PolⅠ主要負(fù)責(zé)rRNA的合成； P

9、olⅢ主要負(fù)責(zé)tRNA和5srRNA的合成,三種RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制劑鵝膏覃堿的敏感性反應(yīng)不同,種類,Ⅰ,,Ⅱ,,Ⅲ,,,,,,對(duì)鵝膏覃堿的反應(yīng),,耐受,極敏感,中度敏感,,,四、啟動(dòng)子與終止子,（一）啟動(dòng)子 1、原核啟動(dòng)子：約55bp,分為起始點(diǎn)（start site）、結(jié)合部位、識(shí)別部位 起始點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始部位以+1表示，轉(zhuǎn)錄的第1個(gè)核苷酸常為嘌呤---G,A    

10、結(jié)合部位：約6bp組成,是高度保守區(qū),共有序列為5‘-TATAAT-3’,位于起始點(diǎn)上游-10。因Tm低,DNA易解開雙鏈，為RNA聚合酶提供場(chǎng)所    識(shí)別部位：約6bp組成,在-35處,為高度保守區(qū),序列5'-TTGACA-3', s因子識(shí)別此部位,* -35和-10都是大致位點(diǎn),啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合DNA的部位，包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件,,,,,,TTGACA盒子,TATA盒

11、子,啟動(dòng)子區(qū),結(jié)構(gòu)基因,-10bp,+1,,轉(zhuǎn)錄,,初級(jí)轉(zhuǎn)錄物RNA,-35bp,2、真核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu),-25處含AT富集區(qū), 共有序列TATAA （TATA box） -70處含共有序列CAAT ,還含許多其它box ,例如:GC-box,E-box等含增強(qiáng)子(enhancer)和靜息子(silencer)    RNA polⅠ和 RNA polⅢ與聚合酶Ⅱ所識(shí)別的啟動(dòng)子差異較大,（二）

12、終止信號(hào),特點(diǎn)：終止部位含GC富集區(qū)與AT富集區(qū),它們分別形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和連續(xù)的U區(qū)，以終止轉(zhuǎn)錄 蛋白ρ因子輔助識(shí)別終止信號(hào)，參與終止,五、轉(zhuǎn)錄過程----轉(zhuǎn)錄起始,1.RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合（σ亞基辨認(rèn)-35區(qū)）,2.DNA雙鏈的打開RNA pol （全酶移向-10區(qū)）,3. RNA鏈上合成第一個(gè)磷酸二酯鍵,5’-pppGpN-OH-3’,,σ亞基脫落,,,轉(zhuǎn)錄過程,(二）延長(zhǎng) 轉(zhuǎn)錄泡：是由DNA雙鏈,RNA聚合酶

13、與新合成的轉(zhuǎn)錄本RNA局部形成的結(jié)構(gòu),它貫穿于延長(zhǎng)過程的始終      過程：在起始階段形成第一個(gè)磷酸二酯鍵后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移動(dòng)，核苷酸之間以3',5'磷酸二酯鍵相連，合成方向5'→3'，合成的RNA自3'末端逐步延長(zhǎng)。合成出的RNA與DNA形成雜交分子,約12bp，因結(jié)合不緊很易脫離,轉(zhuǎn)錄復(fù)合物：酶-DNA-RNA：轉(zhuǎn)錄空泡,,,（三

14、）終止 合成移到終止信號(hào)時(shí),酶不滑動(dòng),聚合停止,轉(zhuǎn)錄完成 特點(diǎn)：ρ因子參與的終止：r因子與RNA產(chǎn)物中富含C的部位結(jié)合,并誘使RNA聚合酶構(gòu)象改變停止滑動(dòng); ρ因子的解螺旋酶活性,利于RNA產(chǎn)物的釋放,（一）原核生物的轉(zhuǎn)錄終止,1. 依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止,2. 不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止,ρ因子,1. 識(shí)別結(jié)合富含C的RNA鏈,功能,2. ATPase活性,3. 解螺旋酶活性,RNA 聚合酶,ρ因子附在RNA鏈上,ρ因

15、子,RNA 鏈形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，ρ因子利用ATP能滑行,ρ因子發(fā)揮解螺旋酶活性，解開發(fā)夾和RNA-DNA,依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止,不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止,四 真核生物轉(zhuǎn)錄特點(diǎn),啟動(dòng)子復(fù)雜,某些基因不含TATA box，由起動(dòng)序列參與基本轉(zhuǎn)錄的開始 順式作用元件:真核生物中轉(zhuǎn)錄起始中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的DNA序列 -35區(qū)　 5 ′-TATA (TATA盒) -70～-110區(qū)　 C

16、AAT盒　 　GC盒（真核TATA序列的位置不像原核-35和-10那樣典型，某些真核生物基因也可以沒有TATA序列）,轉(zhuǎn)錄因子與反式作用因子,轉(zhuǎn)錄因子與反式作用因子: 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子；它們與特異的順式作用元件相互作用,并激活另一基因的轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,結(jié)合順序,,真核轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列，在3'端之后有共同序列AATAAA及多個(gè)GT序列，mRNA在轉(zhuǎn)錄終止序列處被切斷,,,,,,,,AATAAA,GT

17、GTGTG,-----,,AAUAAA,GUGUGUG,AAUAAA,GUGUGUG,,,酶切,,加尾信號(hào),,GC豐富序列,,,,,,AATAAA,GTGTGTG,-----,AAUAAA,GUGUGUG,,,,,,酶切,,(繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但5’端沒有“帽子”，產(chǎn)物被降解）,,,加尾,轉(zhuǎn)錄后的加工,,原核RNA不需加工，邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯,真核RNA需要加工,,rRNA,tRNA,mRNA,,5’加帽,3’加尾,剪接,,在轉(zhuǎn)錄過程中,轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行,

18、第三節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工,意義：轉(zhuǎn)錄生成的前體RNA,無生物學(xué)活性,需加工變?yōu)槌墒?、有活性的RNA 加工種類：剪切與剪接、末端添加核苷酸、修飾、RNA編輯,一、mRNA前體的加工,（一）生成特點(diǎn)： 原核 ：mRNA是多順反子(polycistronic),每分子RNA中含幾種蛋白質(zhì)信息，RNA壽命短，轉(zhuǎn)錄沒完時(shí)翻譯即開始      例:乳糖操縱子，含Z,Y,A三個(gè)基因,分

19、別編碼半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉(zhuǎn)移酶,,真核：?jiǎn)雾樂醋?一個(gè)mRNA僅編碼一種蛋白質(zhì)     外顯子: 在真核生物基因中編碼蛋白質(zhì)的序列      內(nèi)含子:非編碼蛋白的序列,因其插于外顯子之間又稱插入序列,居間序列      hnRNA: 為mRNA的前體,轉(zhuǎn)錄物中外顯子與內(nèi)含子間隔排列，需經(jīng)剪接加工后生成mRNA

20、,（二） mRNA前體加工過程,真核： 5‘末端帽子    部位：核內(nèi) 3‘端多聚A尾 部位：核內(nèi),胞質(zhì)有酶也可進(jìn)行     剪接作用            部位：胞核 甲基化(甲基化發(fā)生在剪接之前,在非編碼區(qū)分子中含1-2個(gè)m6A ) R

21、NA編輯(某些mRNA的核苷酸序列,在生成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后還需插入、刪除或取代一些核苷酸殘基,方能生成具有正確翻譯功能的模板,遺傳信息在mRNA水平上的改變過程，稱為RNA編輯),原核：多順反子mRNA在RNaseⅢ作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閱为?dú)的順反子,5’加帽,pi,5’pppG…,,磷酸酶,,ppi,5’pG…,,,pppG,5’GpppG…,,甲基化酶,＋CH3,mGpppG…,O,H,O,H,帽1,帽0,帽2,,甲基鳥苷5’，5’-三磷酸,3’加

22、尾,,AAUAAA,AAAAAAAAA……….,加尾,,,,,,,AATAAA,GTGTGTG,-----,,AAUAAA,GUGUGUG,AAUAAA,GUGUGUG,,,酶切,轉(zhuǎn)錄的終止,,加尾信號(hào),,GC豐富序列,,polyA尾（約20～200個(gè)A）,A,A,A,A,A,A,,斷裂基因：真核生物的基因由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相隔開但又連續(xù)鑲嵌而成,,外顯子（exon): 基因中出現(xiàn)在mRNA的序列,內(nèi)含子（intron）：

23、 基因中不出現(xiàn)于mRNA而被剪接掉的序列,核內(nèi)不均一RNA （hnRNA）：真核生物中編碼蛋白質(zhì)基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，包括5’帽子、3’poly(A)尾、外顯子、內(nèi)含子，經(jīng)剪接加工成為mRNA,剪接,剪接:在細(xì)胞核內(nèi), hnRNA剪切掉內(nèi)含子,將多個(gè)外顯子連接為成熟mRNA的過程為剪接 例:同一轉(zhuǎn)錄本, 在不同的組織, 因剪接差異產(chǎn)生各自不同的mRNA剪接的本質(zhì)：磷酸酯鍵的轉(zhuǎn)移剪接特點(diǎn) ：剪接部位的結(jié)構(gòu)為內(nèi)含子末端的特定序列

24、，分布在內(nèi)含子的三個(gè)部位，5‘端剪切點(diǎn)為GU;3’端剪切點(diǎn)為AG；靠近3‘端含A序列的分支點(diǎn),,mRNA的剪接： hnRNA被剪接體作用，剪除內(nèi)含子、連接外顯子，產(chǎn)生成熟的mRNA的過程,,外顯子,,內(nèi)含子,,,,,DNA,,mRNA,轉(zhuǎn)錄,形成套索RNA，外顯子靠近,剪接體,,去除套索RNA，外顯子連接,成熟mRNA,mRNA的剪接,套索結(jié)構(gòu),外顯子,外顯子,內(nèi)含子,內(nèi)含子5’端斷開,前一個(gè)外顯子的3’末端攻擊下后個(gè)外顯子的

25、5末端’,前后外顯子的連接,二、tRNA前體的加工,1、切除多余的核苷酸：RNase p切除5' 端多余的核苷酸；Rnase D切除3'端多余的核苷酸2、剪切內(nèi)含子：核酸內(nèi)切酶切除內(nèi)含子,連接酶進(jìn)行連接3、修飾與3‘末端加-CCA: 修飾包括甲基化,脫氨基,還原反應(yīng)等，在核苷酸基轉(zhuǎn)移酶催化下完成3’末端添加CCA,tRNA的加工,,,內(nèi)含子編碼區(qū),,內(nèi)切核酸酶,外切核酸酶,5?,3?,-OH 3’,DNA,內(nèi)含子,,

26、初級(jí)轉(zhuǎn)錄物,3?端加CCA-OH,,3?,,除去內(nèi)含子（內(nèi)切酶與連接酶）,CCA-OH 3?,成熟 tRNA,5?,,,CCA-OH,內(nèi)含子,,5’和3’端的酶切3’加上CCA去掉內(nèi)含子特異部位堿基的加工,三、rRNA前體的加工,（一）特點(diǎn)：     1、rRNA拷貝多,原核5-10個(gè)拷貝;真核:果蠅260個(gè)拷貝;Hela細(xì)胞1100個(gè)拷貝    2、r

27、RNA基因之間以縱向串聯(lián)的方式重復(fù)排列,（二）加工過程,1、剪切作用：需核酸酶參與    2、甲基化修飾：修飾在堿基上     3、自我剪接：一種核酶的作用      5S的加工變化不大     原核rRNA加工：rRNA含非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，其產(chǎn)物中含tRNA

28、     真核rRNA加工： 1. 5S自成體系加工少無修飾和剪接。    2. 45S加工中含剪切和甲基化修飾，需核酸酶,核糖體RNA,18S　　　　5.8S 28S,,,45S rRNA前體,,,,,酶切,,,,32S rRNA前體,前rRNA 20S,,,,,酶切,28SrRNA,5.8SrRNA,18