微小RNA及其生物合成相關(guān)基因在小鼠著床前胚胎中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、微小RNA（MicroRNA，miRNA）是近年新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA；長度為19-25個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，廣泛存在于從線蟲到人類的真核生物中。miRNA具有高度的保守性；大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性；生成miRNA的基因并不是隨機(jī)分布的，從同一個(gè)前體RNA加工而來的共表達(dá)miRNA存在基因簇集現(xiàn)象。成熟的miRNA通過其5’端的5～8個(gè)核苷酸，識別并與靶標(biāo)mRNA序列進(jìn)行完全互補(bǔ)配對或不完全互補(bǔ)配對，引

2、起靶標(biāo)mRNA的降解或翻譯抑制，達(dá)到調(diào)控目的基因表達(dá)的作用。通過上述作用機(jī)制miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用，并在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及腫瘤的發(fā)生等方面起重要作用。
　　自從發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7在線蟲發(fā)育中發(fā)揮作用后，近年有大量的研究表明，miRNA及其生物合成相關(guān)的基因在著床后胚胎發(fā)育的各個(gè)階段都有表達(dá)并對胚胎發(fā)育有影響。但是，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA及其生物合成相關(guān)基因在著床前胚胎中的表達(dá)及其功能。因此

3、，本課題擬開展miRNA及其生物合成相關(guān)基因在小鼠著床前胚胎表達(dá)的研究，以期找到miRNA對著床前胚胎生長發(fā)育、細(xì)胞分化及胚胎基因組激活等方面可能起作用的依據(jù)。
　　目的：建立小鼠的超排、交配和胚胎收集系統(tǒng)，研究miRNA及其生物合成的相關(guān)基因在小鼠著床前胚胎的表達(dá)，探討miRNA在著床前胚胎發(fā)育中的作用和意義。
　　方法和結(jié)果：
　　1.采用miRNA擴(kuò)增結(jié)合miRNA芯片技術(shù)研究了小鼠的卵母細(xì)胞和著床前胚胎中miR

4、NA表達(dá)譜。首次發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞、受精后1.5天（2細(xì)胞）、2.5天（4-8細(xì)胞）和4.5天（囊胚）胚胎中分別表達(dá)55、53、62和72個(gè)miRNA；四個(gè)發(fā)育階段中共篩查到表達(dá)的miRNA94個(gè)，其中有32個(gè)miRNA在四個(gè)發(fā)育階段均表達(dá)（包括16個(gè)在四個(gè)發(fā)育階段均高表達(dá)的miRNA）；其它的62個(gè)miRNA在不同的發(fā)育階段特異性表達(dá)，其中在囊胚期胚胎中特異性表達(dá)一簇從小鼠干細(xì)胞克隆到的miRNAmiR-290～miR-295基因簇。篩

5、查到的miRNA中包括目前功能比較明確的miRNAmiR-155和miR-181，通過對這些miRNA功能的分析，表明著床前胚胎中miRNA的表達(dá)可能對胚胎的早期發(fā)育起調(diào)控作用，并在維持胚胎細(xì)胞的分化中起作用。
　　2.采用qRT-PCR方法研究miR-721和let-7e在小鼠卵母細(xì)胞、4-8細(xì)胞和囊胚中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示miR-721和let-7e的表達(dá)水平在這三個(gè)發(fā)育階段均呈下降趨勢。
　　3.采用RT-PCR的方法

6、研究了miRNA生物合成的相關(guān)基因Dicer1和DGCR8在卵母細(xì)胞和受精后1.5天、2.5天、3.5天和4.5天胚胎中的表達(dá)，結(jié)果表明在卵母細(xì)胞和上述各個(gè)發(fā)育階段均表達(dá)Dicer1和DGCR8基因，他們可能是著床前胚胎miRNA合成的重要基因并對著床前胚胎發(fā)育起作用。
　　結(jié)論：通過成功建立小鼠的超排、交配和胚胎收集系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在小鼠著床前胚胎及卵母細(xì)胞中表達(dá)miRNA及其合成相關(guān)的基因Dicer1和DGCR8。通過對著床前胚胎和